概述与作用机制

3-(Dansylamino)苯硼酸（货号D1454926）是一种双功能小分子，融合了两个化学上截然不同的基团：能与含顺式-1,2-和顺式-1,3-二醇底物可逆共价形成硼酸酯的苯硼酸基团，以及在近紫外区具有强激发、在可见绿光区发射荧光的丹磺酰（5-二甲氨基萘-1-磺酰基）荧光团。

在弱碱性水溶液条件下，硼酸可与糖类及其他多元醇可逆反应，形成五元或六元环状硼酸酯。当硼酸从三角形sp²态转变为四面体sp³硼酸酯态时，局部电子环境发生变化，从而调节丹磺酰荧光强度或发射波长。硼原子杂化状态与荧光团输出之间的这种光物理耦合，是该探针用作比率型或强度型糖类传感器的基础。

丹磺酰基的最大吸收约在330–340 nm，发射峰宽泛，约在500–530 nm，具体取决于溶剂极性。其较大的斯托克斯位移可有效减少自吸收干扰，非常适合酶标仪及荧光显微镜检测格式。

材料与试剂

实验开始前，请准备以下材料：

• 3-(Dansylamino)苯硼酸（阿拉丁货号D1454926）——避光保存固体，储存时需干燥
• 无水二甲基亚砜（DMSO）或甲醇——用于配制储备液
• 磷酸盐缓冲液（pH 7.4–8.5，50–100 mM）——硼酸酯形成的生理相关pH
• 目标分析物：如D-果糖、D-葡萄糖、多巴胺或其他含顺式二醇的化合物
• 已校准的移液器、避光（琥珀色或铝箔包裹）微量离心管
• 荧光分光光度计或酶标仪（激发滤光片约340 nm；发射滤光片约500–530 nm）
• 个人防护装备：丁腈手套、实验服、护目镜

注意：操作前请查阅3-(Dansylamino)苯硼酸的安全数据表（SDS）。避免皮肤长时间接触及粉尘吸入。

分步操作规程

第一步 — 配制储备液

将3-(Dansylamino)苯硼酸溶于无水DMSO中，配制10–20 mM储备液。轻柔涡旋至完全溶解。分装至一次性琥珀色微量离心管中，避光保存于−20 °C。避免反复冻融。

第二步 — 配制工作液

将DMSO储备液稀释至磷酸盐缓冲液（pH 7.4–8.5）中，达到所需工作浓度（通常为10–100 µM）。最终DMSO含量应≤1%（v/v），以避免溶剂干扰硼酸酯平衡。工作液应在实验当天新鲜配制。

第三步 — 建立荧光基线

将200 µL工作液转移至荧光比色皿或黑色96孔板中。在λ_ex ≈ 340 nm / λ_em ≈ 500–530 nm条件下记录基线荧光光谱或荧光强度。读数前，将探针溶液在实验温度（通常25 °C或37 °C）下平衡5分钟。

第四步 — 加入分析物并测量

将顺式二醇分析物（用相同缓冲液配制以避免pH偏移）按浓度梯度加入（如葡萄糖0–50 mM；果糖0–5 mM）。在室温或37 °C下温和振摇孵育5–15分钟后记录荧光发射。在糖类传感中，由于果糖与苯硼酸的结合亲和力更强，通常比葡萄糖产生更强的硼酸酯响应。

第五步 — 数据分析

以荧光强度（或双波长检测时的比率信号）对分析物浓度作图，生成标准曲线。采用标准非线性回归（如1:1结合模型）计算结合常数（K_a）。所有测量结果应以至少三次独立重复实验的均值±标准差报告。

故障排除与注意事项

• 荧光信号弱：检查激发和发射滤光片设置。确认探针已完全溶解；若观察到浑浊，短暂离心处理。确认缓冲液pH在7.4–8.5范围内，因为硼酸酯的形成对pH高度依赖。
• 背景荧光高：降低探针浓度。确保比色皿或微孔板彻底清洁。测量过程中尽量减少环境光照射。
• 对分析物无响应：确认分析物含有顺式二醇基团。检查DMSO含量——高共溶剂浓度可抑制硼酸酯平衡。将孵育时间延长至15–30分钟。
• 重复性差：使用新鲜配制的工作液。平衡期间保持温度恒定。在各重复实验中标准化混合和孵育条件。
• 光敏性：丹磺酰基具有光敏性。孵育期间始终用铝箔包裹探针溶液，并尽量减少紫外线照射。