C3柱的规格

应用：通过HPLC对荧光团和紫外发色团标记的聚糖进行带电分析和纯化。

描述：C3 HPLC柱包含大孔（1000埃）阴离子交换颗粒，其优化用于复杂聚糖混合物的阴离子交换色谱。

颗粒：10μm聚合物基亲水颗粒。官能团–CH2CH2N+(CH2H5)2
色谱柱尺寸               型号 #                                    尺寸
                                C498839                                7.5 x 75毫米

流速：典型流速=0.3-1.0 ml/min最大流速=1.2 ml/min

压力：压力不得超过150psi

pH范围：2-12

温度：典型工作温度=30℃。最大温度范围=10-45℃。

溶剂：运输溶剂–去离子水。

聚糖分析的典型溶剂系统包括水缓冲液的梯度

含有乙腈和甲酸铵、乙酸铵或乙酸钠盐（最大20%乙腈和0.5摩尔盐）

柱保护：过滤所有溶剂至0.2μm，并使用氦气喷射或真空脱气进行脱气。

在加载到柱上之前，使用0.2μm滤膜过滤所有样品。

在注射器和柱头之间安装一个直径为0.2μm的直列式过滤器，以防止颗粒对柱造成损坏。

样本量：可装载在柱上的聚糖样本的最大数量取决于聚糖组分的数量和类型以及任何非聚糖材料的性质。成功分析运行的典型范围是每个样品峰0.1pmol-1 nmol，总聚糖高达200 nmol。

合适的样品：合适的样品包括用以下标签标记的聚糖：2-AB（2-氨基苯甲酰胺）

样品：将样品过滤至0.2μm，然后使用离心蒸发器干燥。

制备：重新溶于5-50μl水中，然后注射。

样品检测：荧光检测器。

处理：确保使用的玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。在所有样品处理程序中使用无粉末手套，避免污染环境碳水化合物。

安全：请阅读所有使用化学品的材料安全数据表（MSDS）。

所有涉及标记试剂的过程都应使用适当的个人安全防护措施——安全眼镜、耐化学手套（如丁腈橡胶）等。-并且在适当的情况下放置在实验室通风柜中。

仅供研究使用。不用于人类或药物

HPLC系统要求
C3柱可与能够以0.3至1.0ml/min的流速递送准确梯度的HPLC系统一起使用。通常，在高压下（在泵头之后）混合洗脱液的系统具有较低的死体积，并提供更准确的梯度，该梯度适合于柱所需的流速。

对于直径为7.5 mm的柱，将样品注入高达100μl的起始缓冲液（即溶剂混合物在HPLC梯度开始时使用）。

荧光检测器需要具有以下检测波长：

为了实现最佳检测，请使用宽狭缝宽度（例如10–20 nm）。亚微微摩尔水平的2-AB标记聚糖可以以良好的信噪比检测（取决于所用检测器的灵敏度）。

为了提高聚糖分析的重复性和中间精度，使用柱温度控制器。

立柱的安装

在立柱安装过程中，我们建议：

• 应使用PEEK接头和管道（10.32（1/16“）ID）将C3柱连接至HPLC。建议手动拧紧接头，以便于连接并尽量减少对柱螺纹的损坏。流向由列标签上的箭头指示。

• 保持注射器到柱和柱到检测器之间的管道长度尽可能短，以尽量减少分散效应。

• 在注射器之前或注射器和C3柱顶部之间安装一个0.2μm的直列式过滤器，其最小死体积，以防止颗粒对柱造成损坏。

• 在分析任何样品之前，应使用以下协议对新安装的柱进行调节。

新安装立柱的预处理

在使用C3柱之前，建议采取以下预处理步骤：

按顺序用以下洗脱剂以1.0ml/min的流速依次冲洗色谱柱：

• 溶剂A-20%乙腈30分钟。

• 溶剂B-500 mM甲酸铵，pH 9.0，在20%乙腈中（用200mL水和50mL乙腈稀释50mL C-BUFFX4）30分钟。

• 用溶剂A平衡30分钟

准备新安装的聚糖分析柱，如下所示：

• 通过运行两个完整的溶剂梯度循环（见下文）对柱进行预处理，无需注入任何样品。

柱清洁和储存

大量使用后，您的C3柱可能被强吸附的样品成分污染，从而导致柱性能下降。

• 按照上述“柱预处理”部分中的协议清洁柱。然后，在适当的起始缓冲液中平衡，在不注入样品的情况下运行梯度以检查基线。

• 将柱储存在溶剂A–20%乙腈中。

样品制备

用于C3柱电荷模式分析的样品应不含盐或阴离子洗涤剂，也不含任何颗粒。样品应在水中或20%乙腈中配制，以便注射到HPLC上。

如果暴露于温度升高的酸性条件下，唾液酸化的聚糖可能会脱分析。通过（a）尽量减少暴露于酸性条件（如果可能，保持pH值高于5），以及（b）尽量减少温度高于25℃，避免对此类样品进行脱分析。

使用具有0.2μm孔径膜的微离心过滤器可以从样品中去除颗粒。

阴离子和中性甘氨酸的电荷模式分析

使用2-AB甘氨酸标记试剂盒，然后使用C3 HPLC，通过使用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）荧光标记，可以分析微微摩尔量（或更少，取决于检测器的灵敏度）的寡糖。

程序概要如下：

• 寡糖用2-AB还原胺化标记。

• 然后使用S盒去除多余的标记试剂。

• 标记的寡糖通过阴离子交换HPLC在C3柱上进行分析，荧光检测。

以下协议旨在指导使用C3柱的条件。始终使用HPLC级缓冲盐和溶剂以及纯水。我们建议使用C缓冲液（500 mM甲酸铵缓冲液，pH值9，20%乙腈v/v）而不是较低pH值的溶剂，因为较高的pH值确保所有阴离子聚糖（唾液酸、硫酸化和磷酸化糖）都处于负电荷状态。较低pH的溶剂（例如pH 4.4）可用于唾液酸化聚糖的分离，但这低于磷酸化聚糖的pKa值。

以下是三种不同溶剂的详细信息。甲酸铵是一种特别有用的溶剂，因为它是挥发性的，在从柱上洗脱后收集样品后，在N（或其他HILIC）柱上进行正交分离之前。

500mM甲酸铵pH 9溶剂

建议使用C溶剂分离所有带负电荷的聚糖，包括磷酸化聚糖和硫酸聚糖。（用200mL水和50mL乙腈稀释50mL C-BUFFx4产品）。

立柱：C3–7.5 x 75 mm

溶剂：溶剂A=20%乙腈。

溶剂B＝在20%乙腈中pH为9的500mM甲酸铵。

流速：0.4-0.8 mL/min。

梯度：

注：含有五种或更多唾液酸的聚糖可能需要更高百分比的溶剂B。

荧光检测：

                  λex=330 nm，λex=420 nm

图1：使用pH 9溶剂从C3 7.5 x 75mm的牛胎球蛋白中分离2AB标记的N-聚糖

1S、2S、3S和4S表示单、二、三和四唾液酸化聚糖峰。N=中性聚糖

500mM Ammonium Formate pH 4.4 Solvent

该溶剂仅推荐用于分离唾液化聚糖（50毫升Ludger产品N-BUFFx40与200毫升水和50毫升乙腈一起稀释）

立柱：C3–7.5 x 75 mm

溶剂：溶剂A=20%乙腈

溶剂B=500mM甲酸铵，pH 4.4 in 20%乙腈

流量：0.4-0.8 ml/min

梯度：

注：含有五种或更多唾液酸的聚糖可能需要更高百分比的溶剂B。

荧光检测：

                       λex=330nm，λex=420nm

图2：使用pH 4.4溶剂将C3 7.5 x 75mm上标有N-聚糖的2AB与牛粪分离。

1S、2S、3S和4S指示单唾液化聚糖峰值。N=中性聚糖。

500 mM醋酸铵pH 4.5溶剂

立柱：C3–7.5 x 75 mm

溶剂：溶剂A=20%乙腈。

溶剂B=500mM醋酸铵，pH 4.5 in 20%乙腈

流速：0.8ml/min。

梯度：

注：含有五种或更多唾液酸的聚糖可能需要更高百分比的溶剂B

荧光检测：

                      λex=330nm，λex=420nm

图3：使用醋酸铵基溶剂分离C3 7.5 x 75mm上2AB标签聚糖标准（皮摩尔浓度）。

附件1：故障排除指南

C3充电模式分析是一种强大的方法。如果出现问题，通常可以毫无困难地纠正。以下是最可能问题、可能原因和解决方案的指南。

A.样本未保留在色谱柱中

1.聚糖是非阴离子的。已删除未熊阴离子组或阴离子组的聚糖（例如，样本已解构）。通过减少样品暴露于酸性条件和提高温度来最小化脱溶。

2.色谱柱可能不完全平衡。确保柱在溶剂A（水中20%乙腈）中充分洗涤，以清除柱中的所有盐。

3.样品中含有导致自愈的盐。确保样品装入水中或溶剂A，并清除所有盐迹。

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