N2 色谱柱的规格

应用：通过HPLC分析和纯化荧光团和紫外发色团标记的聚糖。

描述：N2 HPLC柱含有聚合物酰胺涂层的颗粒，该涂层优化了复杂聚糖混合物的高分辨率色谱。

颗粒：3μm粒径，80埃孔径，聚合物酰胺涂层。

色谱柱尺寸                   型号 #                                    尺寸

                              C498853-01                          2.0 x 150 mm

                              C498853-02                          4.6 x 150 mm

流速：4.6mm柱的典型流速=0.4-1.0 ml/min                 2.0mm柱的典型流速=0.15-0.22ml/min

色谱柱的最大压力4.6mm=2250 psi（150 kg/cm2）       2.0mm=2900 psi（195 kg/cm2）
pH范围：2.0-7.5

温度：典型工作温度=30℃，温度范围=10-40℃。

溶剂：聚糖分析的典型溶剂系统包括乙腈梯度和pH 4.4 含甲酸铵的水缓冲液，推荐的缓冲液为pH 4.4，50 mM甲酸铵，其以50ml等分试样提供，用于补充2升。(Aladdin catalog#：N498870-50ml)

运输溶剂：75%乙腈-25%水

储存：对于长期储存，应以从操作缓冲液至100%水的梯度洗涤，然后至>50%乙腈水溶液（v/v）的储存溶剂。

色谱柱保护：将所有溶剂过滤至0.2μm，并使用氦气喷射或真空脱气进行脱气。在加载到柱上之前，使用0.2μm滤膜过滤所有样品。在样本注射器和柱之间安装一个直列式过滤器。

样本量：可装载在柱上的聚糖样本的最大数量取决于聚糖组分的数量和类型以及任何非聚糖材料的性质。成功分析运行的典型范围为10fmol-每个样品峰1 nmol，总聚糖高达200 nmol。

合适的样品：合适的样品包括用以下标签标记的聚糖：2-AA（2-氨基苯甲酸）、2-AB（2-氨基苄酰胺）、AA-Ac（3-（乙酰氨基）-6-氨基吖啶。

样品：过滤样品至0.2μm，然后使用离心蒸发器干燥。

准备：对于4.6mm柱，将样品注入高达100μl的起始缓冲液（即HPLC梯度开始时使用的溶剂混合物）中。对于2mm柱，将样品注入高达25μl的起始缓冲液（即HPLC梯度开始时使用的溶剂混合物）中。

样品检测：荧光、质谱或紫外吸收率取决于所用染料。

HPLC系统要求

N2色谱柱可与高效液相色谱系统一起使用，该系统能够以0.3至1.0ml/min的流速（对于直径为4.6mm的柱）或50至300μl/min（对于直径2mm的柱）提供准确的梯度柱。通常，在高压下（在泵头之后）混合洗脱液的系统具有较低的死体积，并提供更准确的梯度，该梯度适合于色谱柱所需的流速。

对于4.6mm柱，将样品注入高达100μl的起始缓冲液（即HPLC梯度开始时使用的溶剂混合物）中。对于2mm柱，将样品注入高达25μl的起始缓冲液中。

荧光检测器需要具有以下检测波长：

荧光标签                                              λex                λem 

                                            (nm)             (nm)
2-AB[2-氨基苯甲酰胺]                         330              420

2-AA[2-氨基苯甲酸]                             330              420

AA Ac[3-（乙酰氨基）-6-氨基吖啶]  442              525

为了实现最佳检测，请使用宽狭缝宽度（例如10–20 nm）。亚微微摩尔水平的2-AB或2-AA标记的聚糖可以以良好的信噪比检测（取决于所用检测器的灵敏度）。

为了提高聚糖分析的重复性和中间精度，使用柱温度控制器。柱温为35℃时可获得良好的结果。

色谱柱的安装

在色谱柱安装期间，我们建议：

• 您应该使用不锈钢或PEEK（聚醚醚酮）的标准1/16” OD 管和10-32 (1/16”) 接头将N2柱连接到您的HPLC 系统。 建议使用手拧式 PEEK 接头和管道（0.17 mm / 0.007” ID）以方便连接并最大限度地减少对色谱柱螺纹的损坏。 流向由柱标签上的箭头指示。

• 使进样器到色谱柱和色谱柱到检测器之间的管道长度尽可能短，以尽量减少分散效应。

• 在进样器和 N2 柱头之间安装一个死体积最小的 0.2 μm 在线过滤器，以防止颗粒损坏色谱柱。

• 如果将两个 150 x 2mm 柱连接在一起，则使用尽可能短的管子。

• 在分析任何样品之前，按如下方式调节新安装的色谱柱。

色谱柱清洁和储存

大量使用后，N2柱可能会被强吸附的样品成分污染，从而导致柱性能下降。

样品制备

应使用N2柱分析纯化的聚糖（荧光标记或未标记）。

样品必须无微粒。在加入乙腈之前，应将样品溶解在水中，使其组成与梯度开始时相同（例如，将样品溶解于35μl水中，然后在注射前加入65μl乙腈，以使用N-聚糖分析梯度法运行）。

过滤样本

通过带有0.2μm孔径膜的旋转过滤器或注射器过滤器过滤，去除样品中的颗粒。

唾液酸化甘氨酸

如果暴露于酸性条件和升高的温度，唾液酸化聚糖可能会脱分析。通过以下方式避免对此类样品进行脱分析：

a、 尽量减少接触酸（如果可能，保持pH值在5-8之间），以及

b、 尽量减少暴露于25℃以上的温度。

4.6 x 150 mm立柱的操作计划和系统适用性测试

• 以下列出了两种运行方法：从35%A开始的30分钟运行适用于N-聚糖的分析；从20%A开始的60分钟运行适用于O-聚糖和N-聚糖的分析

• 开始分析时，通过运行启动方法缓慢提高流速：N2-10m-Start-35%用于N-聚糖分析，N2-10m-Start-20%用于O-聚糖和N-聚糖分析

• 随后，在没有样品的情况下运行一个完整的梯度，用运行方法调节色谱柱：N2-30m-Nlink-35%：N-甘氨酸分析梯度或N2-60m-ONlink-20%（梯度方法见下文）

• 使用N2-30m-Nlink-35%或N2-60m-ONlink-20%梯度运行以下系统适用性标准之一：

图1：采用N2-30m-Nlink-35%方法在4.6 x 150 mm N2柱上运行2-AB GHP的典型HPLC色谱图。

样品注入35%水溶液、65%乙腈中。

图2：在4.6 x 150 mm N2柱上使用N2-60m-Nlink-20%方法进行2-AB GHP运行的典型HPLC色谱图。

样品注入20%水溶液、80%乙腈中。

• GHP系统适用性曲线应与图1中使用N2-30m-Nlink-35%梯度的曲线相似，如果使用N2-60m-Nlink-20%梯度，则应与图2相似。

• 如果此时所有12个峰均未洗脱，则这可能是由于HPLC系统中的高死体积所致。增加运行时间以将其考虑在内。（例如24分钟内35-47%A的梯度）

• 峰应对称，如果有拖尾或峰太宽，则尝试清洗色谱柱（参见章节：色谱柱清洗和储存）或更换新色谱柱。

• 大约每10次样品运行，继续运行荧光标记的GHP适用性标准。

• 通过将峰的洗脱时间表示为葡萄糖单位（GU），GHP阶梯也可用于针对日常和系统间的变化进行校准。通过将三次样条分布曲线拟合到GHP阶梯（图1中的GU 1-12）来计算GU值，然后使用该曲线从保留时间分配GU值。这些GU值对于中性聚糖（+/-0.03）非常可重复，唾液酸化聚糖的变化更大（+/-0.3），可以与数据库值进行比较。

用4.6 x 150 mm LS-N2酰胺HPLC柱进行甘氨酸分析

溶剂

本指南中的聚糖分析梯度基于以下溶剂：

溶剂A:50 mM甲酸铵，pH 4.4，（50 ml N-BUFFX40，用水稀释至2升）

溶剂B：乙腈
    

梯度N2-10m-Start-35%：N-甘氨酸分析启动

用作N聚糖分析梯度的启动方法，从35%A开始

梯度N2-30m-Nlink-35%:N-甘氨酸分析梯度

用作GU介于4和12之间的N-聚糖分析的梯度

梯度N2-10m-Start-20%:O-甘氨酸和N-甘氨酸分析启动

用作分析O-聚糖和N-聚糖的梯度启动方法，从20%a开始.

两个2.0 x 150 mm柱的运行计划和系统适用性测试
两个2.0 x 150 mm的柱可以串联连接在一起，以获得两倍的柱长度。这种设置产生的分辨率与使用一个4.6 x 150 mm柱获得的分辨率相似，其优点是将溶剂用量减少到较大直径柱所需的三分之一。可以使用单个列，但分辨率不高。

•N-聚糖分析方法如下所示。

•开始分析时，通过运行启动方法缓慢提高流速：N2x2-5m-Start-30%

•通过在没有样品的情况下运行一个完整的梯度，以调节柱的运行

 方法：N2x2-60m-Nlink-30%

•使用N2x2-60m-Nlink-30%运行以下系统适用性标准之一

图3：在两个串联的2 x 150 mm N2柱上使用N2-30m-Nlink-35%方法进行2-AB GHP运行的典型HPLC色谱图。

样品注入30%水溶液、70%乙腈中。

用两个2 x 150 mm N2酰胺HPLC柱进行甘氨酸分析

溶剂

本指南中的聚糖分析梯度基于以下溶剂：

溶剂A：50mM甲酸铵pH 4.4，

（50 ml产品N-BUFFX40用水稀释至2升）

溶剂B：乙腈

梯度N2x2-5m启动-30%：N-甘氨酸分析启动

用作N聚糖分析梯度的启动方法，从30%a开始。

梯度N2x2-30m-Nlink-30%:N-甘氨酸分析梯度

用作GU介于4和12之间的N-聚糖分析的梯度

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