荧光素–荧光素酶反应是什么？它是如何运作的？

         在自然界中，生物发光是化学能转化为可见光的过程。这一现象存在于多种生物中——包括萤火虫、某些真菌和许多海洋物种——它们利用这种现象进行交流、捕食或伪装。

         在分子水平上，该反应发生在荧光素酶（luciferase）催化荧光素（luciferin）氧化时，并产生光作为副产物。该反应需要 ATP、氧气和镁离子的参与。荧光素在酶的作用下被氧化生成氧化荧光素（oxyluciferin），同时产生二氧化碳（CO₂）、腺苷单磷酸（AMP）以及一个光子。

荧光素酶检测的主要用途是什么？

         荧光素酶检测是评估启动子强度和活性的重要工具。例如，如果你想研究某一启动子区域的转录情况，可以将荧光素酶基因置于该启动子下游。当转录发生时，细胞会产生荧光素酶，其发光强度直接反映了启动子的活性。通常，信号越亮，意味着荧光素酶产量越高，也说明该启动子越强。

         常见的一个问题是：研究基因表达时，应该选择荧光素酶检测还是 qPCR？它们的区别在于：

• qPCR：测量基因转录本的丰度，但不能直接揭示转录调控机制。
• 荧光素酶检测：可实时评估启动子激活和转录调控情况。

         如果你的目标是全面了解基因调控机制，将两种方法结合使用会更有价值——qPCR 用于定量转录本，荧光素酶检测用于评估由启动子驱动的转录控制。

进行荧光素酶检测需要什么？

         在列出所需材料之前，先明确本讨论的范围——特别是如果你是初学者。此处所述的荧光素酶检测是在细胞内进行的。虽然荧光素–荧光素酶反应也可应用于其他模型（如小鼠），但那属于生物发光成像（BLI）。

         BLI 同样依赖荧光素，但其仪器、操作流程和实验方案与标准的细胞荧光素酶检测有很大不同。本文只聚焦于细胞水平的荧光素酶检测，不涉及 BLI 的细节。

         你需要准备适当的试剂，获取方式有两种：

试剂

• 使用完整试剂盒：将所有必要成分打包提供。
• 单独购买：分别采购每一种所需成分。

设备：发光检测仪（Luminometer）

         荧光素酶检测的核心设备是发光检测仪。如果你已经拥有一台，需要确定它是微孔板读数型还是单管型，并注意以下信息：

• 是否配备自动进样器
• 可检测的波长范围
• 支持的温度设置

         微孔板型发光检测仪可以测量 96 孔至 384 孔板中的样品，非常适合高通量工作流程。相比之下，单管型检测仪一次只能测量一个离心管样品。

         配备进样器的检测仪在进行瞬发型（flash）荧光素酶检测时尤其重要——这种检测类型灵敏度高，但信号半衰期短。进样器可在测量瞬间将荧光素注入样品，确保多样品测量的一致性和准确性。

孔板 / 管

         根据你使用的发光检测仪类型，选择与之兼容的试管或孔板。

         常见的孔板类型：

• 平底板
• 透明板
• 白色或不透明板
• 白色板（透明底）

         不同孔板材料与设计会影响光反射、信号强度和背景噪声。

         平底板是此类检测的必需品，优于圆底板，因为它们的设计更适合光学测量和细胞培养，能确保结果准确一致。

         透明孔板方便观察裂解液，但可能引入相邻孔的背景发光。白色孔板能消除这种干扰，但不便于观察裂解液。白色透明底孔板则兼顾可视性与低背景，但价格较高。

表1：孔板类型比较

是否需要使用试剂盒？荧光素酶检测试剂盒包含哪些成分？

         你是否必须使用试剂盒来进行荧光素酶检测？

         简短的回答是：不必须。你完全可以自行采购荧光素（luciferin）、ATP 以及其他试剂，然后按照已有的标准实验方案开展检测。

         在单独购买试剂时，试剂质量至关重要，尤其是荧光素——其纯度差异会直接影响实验结果。选择荧光素时，还需考虑其溶解性、检测兼容性等因素。关于使用荧光素/荧光素酶的一般性注意事项，可作为参考依据。

使用试剂盒的优势

         虽然并非必需，但试剂盒在便利性与一致性方面具有显著优势：

• 预配缓冲液：无需自行配制反应缓冲液，试剂盒已包含。
• 预称量荧光素：省去称量步骤，减少准备误差。
• 实验一致性：标准化组分有助于提高可重复性。
• 对初学者更友好：免去选择荧光素形式（钠盐、钾盐或游离酸）或缓冲液配方的困扰。

         如果你已经具备除荧光素和缓冲液之外的大部分试剂，那么选择试剂盒可以确保你获得所需成分，而无需额外查找资料。

试剂盒成分示例

         不同产品的试剂盒成分可能有所差异。例如，Aladdin D829607 Renilla-萤火虫双荧光素酶检测试剂盒包含：

• 细胞裂解缓冲液（5x）
• 萤火虫荧光素酶反应缓冲液
• 萤火虫荧光素酶底物
• 终止 & Renilla 反应缓冲液
• · Renilla 荧光素酶底物（50x）

荧光素酶检测的基本步骤

         无论是进行双报告基因检测还是单报告基因检测，荧光素酶检测的核心步骤在很大程度上是相同的：

         1. 选择荧光素酶报告基因
         根据实验目标选择荧光素酶类型（如萤火虫 luciferase 或 Renilla luciferase）。对于双报告实验，应选择具有不同光谱发射特性的荧光素酶，以避免信号重叠。

         2. 将报告基因克隆到质粒中
         将所选的报告基因插入质粒载体中。对于双报告实验，可将第二个报告基因克隆到另一质粒中。

         3. 共转染实验细胞
         将质粒导入目标细胞，通常采用共转染方式。

         4. 培养并裂解细胞
         培养 24–48 小时以允许报告基因表达。随后去除培养基并裂解细胞。

         5. 加入含荧光素的缓冲液
         将细胞裂解液与含荧光素的缓冲液混合。荧光素酶–荧光素反应会产生光信号，通过发光检测仪进行定量测量。

         以上步骤构成了荧光素酶检测的基本工作流程，但具体细节会根据检测类型、报告基因的选择及实验目标而有所不同。

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应选择哪种荧光素酶检测方法？

         荧光素酶检测有多种类型，包括瞬发型（flash）和长效型（glow）格式。此外，还可选择单报告或双报告检测（极少情况下会用到三报告系统）。最佳选择取决于实验需求、可用设备以及所需灵敏度。

瞬发型（Flash）检测

         瞬发型是最常见的荧光素酶检测类型。底物加入后，反应几乎瞬间发生，产生短暂但强烈的光信号。由于信号衰减速度快，测量时间非常有限。

         在使用单管检测时，这种方式易于管理，但在高通量（如 96 孔板）条件下会变得具有挑战性。例如，若使用多道移液器为 96 孔板加底物，当最后几孔加入底物时，最初的孔位已失去峰值信号。一个解决办法是一次只加底物并立即测量单孔，但这需要精确的操作、统一的时间控制和高度专注才能保证重复性。

         配备自动进样器的发光检测仪可完美解决此问题，能在底物加入的瞬间读取信号，确保各孔测量时间一致。不过，进样器系统会消耗更多底物，因为在进样过程中难免会有损耗。

优势：

• 高灵敏度——可检测到极微小的信号变化
• 适用于对灵敏度要求极高且设备支持快速自动进样的实验

长效型（Glow）检测

         如果没有配备进样器的发光检测仪，但仍需稳定处理大量样品，长效型荧光素酶检测是一个实用的选择。这类检测信号持续时间更长，可为多孔加底物留出充足时间，信号衰减速度较慢。

特点：

• 信号持续时间长——可连续测量多个样品而无需匆忙
• 适合高通量流程和多板实验
• 与瞬发型相比，灵敏度较低

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单报告基因检测 vs 双报告基因检测

单报告基因检测（Single Reporter Assay）

         当你希望在研究基因表达的同时降低成本和缩短实验时间时，单报告检测是一种具有吸引力的选择。在这种方法中，只使用一种荧光素酶系统——例如萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）配合荧光素（luciferin），或 Renilla 荧光素酶配合腔肠素（coelenterazine）——作为底物来产生可测的光信号。

• 优势：比多报告系统更简单、经济
• 局限：缺乏用于归一化（Normalization）的内参对照，与双报告系统相比在结果的精确度和细节上可能有所不足

双报告基因检测（Dual Reporter Assay）

         双报告系统（最常见的是萤火虫荧光素酶 + Renilla 荧光素酶组合）通过数据归一化可显著提高结果的准确性。

         在这种系统中：

• 一个报告基因（如萤火虫荧光素酶）用于测量实验启动子的活性
• 第二个报告基因（如 Renilla 荧光素酶）作为转染效率的对照

示例设计：

• 萤火虫荧光素酶（绿色发光）用于测量实验条件
• Renilla 荧光素酶（蓝色发光）连接到组成型启动子，用于评估转染效率和细胞活性
• 在某些实验设计中，这两个角色也可以互换

         在执行双报告检测时，必须选择光谱特性不同（即发射波长不同）的荧光素酶，以保证信号读取的准确性。

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参考文献

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阿拉丁：https://www.aladdin-e.com