简介
        在含有 50 mM 磷酸钠、50 mM 氯化钠和 2 mM 乙二胺四乙酸的 pH 值为 7.5 的缓冲溶液中，马来酰亚胺-PEG 改性药物可与抗体共轭。然后在 30 ℃ 下用不同摩尔当量的 DTT 还原抗体中的二硫桥 30 分钟，从而在抗体分子上获得不同数量的可用巯基，然后将还原抗体与不同摩尔当量的马来酰亚胺-PEG 改性药物共轭，以获得一系列不同的 DAR。

条件：a. DTT，30 ̊C 30 分钟；b. 马来酰亚胺-药物，PBS，7.4，EDTA

方案举例

          在 4.8 mL 抗体（10 mg/mL）中加入 600 uL 500 mM 硼酸钠/500 mM NaCl（pH 8.0），再加入 600 uL 100 mM 二硫苏糖醇（DTT）水溶液。37°C 孵育 30 分钟后，用含有 1 mM 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的 PBS 通过 Sephadex G-25 树脂洗脱缓冲液。

          硫醇-抗体值是根据 280 纳米吸光度测定的还原 mAb 浓度来确定的，硫醇浓度是通过与 DTNB（5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）反应并在 412 纳米处测量吸光度来确定的。

共轭 
          在还原抗体中加入含 1 mM DTPA 的 PBS（PBS/D），使最终反应混合物中的抗体浓度为 2.5 mg/mL，然后将溶液冷却。从已知浓度（约 10 mM）的冷冻二甲基亚砜（DMSO）储备溶液中稀释药物连接剂，配制用于连接的药物连接剂溶液，加入足量的乙腈，使连接反应混合物为 20% 有机物/80% 水溶液，并将溶液置于冰上冷藏。经计算，药物连接剂储备液的体积为 9.5 摩尔药物连接剂/1 摩尔抗体。将药物连接剂溶液在搅拌下迅速加入冷还原抗体溶液中，然后将混合物在冰上放置 1 小时。

分离 
          然后从 PBS/D 中新鲜制备的 100 毫摩尔溶液中加入比马来酰亚胺多 20 倍的半胱氨酸，以淬灭共轭反应。当温度保持在 4°C 时，用离心超滤浓缩反应混合物，并通过在 PBS 中平衡的 Sephadex G25 进行缓冲液交换。然后在无菌条件下用 0.2um 过滤器过滤共轭物，并将其储存在 -80°C 温度下进行分析和检测。

分析 
          用紫外吸光度分析 ADC 的浓度，用尺寸排阻色谱分析 ADC 的聚集，用 DTNB 测量未反应的硫醇分析药物/抗体，用反相高效液相色谱分析残留的游离药物。
注意：
          1. 还原单克隆抗体的二硫键不应影响其功能。TCEP 和二硫苏糖醇（DTT）是最常用的还原试剂。

          2.链间二硫键比链内二硫键更容易还原。这样就可以在温和的还原条件下产生游离的硫醇基团，同时保持抗体完整。用 TCEP 或 DTT 进行有限还原，主要得到药物附着在重-轻链二硫键上的共轭物；用 5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）对完全还原的抗体进行部分再氧化，得到药物主要附着在重-重链二硫键上的共轭物。
          3. 半胱氨酸-马来酰亚胺共轭位点具有高度异质性

          在人类 IgG1 中，有四个链间二硫键可用作潜在的结合位点。这四个链间二硫键可被三（2-羧乙基）膦（TCEP）或二硫苏糖醇（DTT）还原，从而产生八个硫醇基团，用于连接药物分子。通过这种方法，可以针对 2-4 个典型的药物抗体比（DAR）获得不同的药物抗体比（DAR）共轭物。此外，每种药物抗体比的抗体-药物共轭物都有几种异构体。因此，抗体-药物共轭物中存在一百多种不同的异构体。虽然采用半胱氨酸残基作为连接位点的传统方法具有高度异质性。

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