本实验介绍关于胰岛素受体糖基化的分析。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。

操作方法

胰岛素受体糖基化的分析实验

材料与仪器

纯化的胰岛素受体 内切糖苷酶 F 内切糖苦酶 H 神经氨酸酶 甘油 蛋白酶抑制剂储液 内切糖苷酶 F 缓冲液 内切糖苷酶 H 缓冲液 神经氨酸酶缓冲液 SDS-PAGE 样品缓冲液
凝胶电泳装置 X-射线胶片和暗盒

步骤

材料与设备

纯化的胰岛素受体，得自胰岛素-琼脂糖柱层析（见本单元实验 4）

内切糖苷酶 F(N-聚糖酶；Boehringer Mannheim Corp.903329 或 Genzyme Corp.)

内切糖苦酶 H(Boehringer Mannheim Corp.100117 或 Genzyme Corp.ENDO HI)

神经氨酸酶（Boehringer Mannheim Corp.1080725 或 Sigma Chemical Co.type X,N2133)

凝胶电泳装置（BioRadLaboratories 或 HoeferScientificInstruments)

甘油（10%)

X-射线胶片和暗盒

试剂

蛋白酶抑制剂储液（100X)(供糖基化实验用)

内切糖苷酶 F 缓冲液（5x)

内切糖苷酶 H 缓冲液（10x)

神经氨酸酶缓冲液（10x)

SDS-PAGE 样品缓冲液（5x)

(配方，见"试剂的配制"，pp.234~240)

搡作程序

1) 按本单元实验 5 所述的操作程序（步骤 1~5), 对由胰岛素-琼脂糖柱纯化的第5 号管的胰岛素受体进行亲和标记。配制 4 管完全相同的样品，分别标上 A、B、C 和 D。

注：每管的总体积为 62ul。

2) 建立如下反应体系：

样品 A(对照)

a. 加 1ul 100x 的蛋白酶抑制剂储液。

b. 加 17ul H₂O 。

样品 B(内切酶 F 处理）

a. 加 16ul 5x 内切糖苷酶 F 缓冲液。

b. 加 2ul 内切糖苷酶 F。

c. 加 1ul 100x 蛋白酶抑制剂储液。

样品 C(内切酶 H 处理）

a. 加 8ul 10x 内切糖苷酶 H 缓冲液。

b. 加 3ul 内切糖苷酶 H。

c. 加 1ul 100X 蛋白酶抑制剂储液。

d. 加 6ul H₂O 。

样品 D(神经氨酸酶处理）

a. 加 8ul 10x 神经氨酸酶缓冲液。

b. 加 3ul 神经氨酸酶。

c. 加 lul 100x 蛋白酶抑制剂储液。

d. 加 6ul H₂0。

3) 以上样品于 37°C 孵育 4 h。

4) 加 20ul 5x SDS-PAGE 样品缓冲液，停止反应。

5) 样品煮沸 5 min。

6) 加样于 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，170V 电压下电泳，直至染料前沿离开凝胶。（关于 SDS-PAGE 的进一步介绍，见附录 5。）

7) 将凝胶在 10% 甘油中浸泡 10 min, 然后用干胶器干燥。

8) 用放射自显影法鉴定亲和标记的胰岛素受体。

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