A 组轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原物， 迄今尚无特效药， 仅有两种重配减毒活疫苗上市， 但尚存在保护谱有限， 病毒毒力恢复等安全隐患。研究轮状病毒的发病机制以研制有效的疫苗和靶向药物就显得尤为重要。从 20 世纪 80 年代起， 人们开始探索与人源轮状病毒临床感染表现， 组织病理改变等方面与人感染接近的动物实验模型。在研究初期， 都是用大型哺乳动物如新生牛羊、猪等， 但是存在着种属限制性、动物遗传背景复杂。 繁殖能力弱、无菌性不能保证、实验费用高和特异性动物抗体很难从商业渠道获得等缺点， 人们转而将目光转向遗传背景清楚、繁殖能力强的小型哺乳动物， 包括家兔、大鼠。 小鼠等常用实验动物。这些动物易于获得近交系、SPF 级别， 易于增加实验样本数， 增加了实验数据的可靠性以及大大降低实验费用。但是必须指出， 由于轮状病毒存在非常明显的种属限制性， 迄今尚未有真正理想的人源轮状病毒动物模型 （animal modlels of rotavirus－infection）。未来可望在了解病毒宿主相互作用机制及病毒受体的前提下， 通过转基因动物方面建立理想动物模型。

原理

轮状病毒腹泻发病机制迄今尚不明确。早期研究表明腹泻是由小肠黏膜的破坏所导致的。轮状病毒感染导致小肠绒毛缩短变平， 绒毛顶部的柱状上皮细胞丧失， 其正常的刷状缘为隐窝部无刷状缘的立方形细胞所取代。

由于新生的上皮细胞功能低下， 且吸收面积变小， 造成肠吸收不良。其次是乳糖酶的缺乏。Holmes 等指出， 小肠上皮细胞的乳糖酶最大活性表达位置是绒毛的顶部成熟吸收细胞， 因此对绒毛损伤尤为敏感， 易造成继发性乳糖吸收不良。由于肠黏膜的破坏， 新生的上皮细胞乳糖缺乏更加剧这种作用。同时， 由于细菌对乳糖的分解， 产物堆积还可造成肠腔渗透压的升高， 造成渗透性腹泻。但是对于早期肠道黏膜未出现损伤时， 或病理检查无肠道病理损害时出现的腹泻， 不能用上述理论加以解释。

近年来有研究认为肠上皮细胞坏死不明显， 而突出的病理表现是小肠绒毛广泛的空泡样变性。轮状病毒腹泻机制复杂， 尚不明确。可能的机制包括肠黏膜损害引起吸收不良， 病毒毒素作用， 肠神经系统 （enteric nervoussystem ， ENS） 受到刺激、绒毛缺血。 多种细胞因子参与作用等均参与了轮状病毒腹泻的发病机制。

应用

轮状病毒感染动物模型的常用应用领域如下：研究轮状病毒感染的动物模型一般可分为 2 类， 一类是单纯用于感染的模型。 常用成年鼠； 一类是腹泻模型， 感染后动物出现腹泻。由于成年动物对轮状病毒感染的敏感性较低， 因此大多数报道的轮状病毒感染研究都是在低龄动物上进行的。新生小鼠是国际上公认的轮状病毒感染最佳的动物模型。

操作方法

轮状病毒感染动物模型

原理

轮状病毒腹泻机制复杂， 尚不明确。可能的机制包括肠黏膜损害引起吸收不良， 病毒毒素作用， 肠神经系统 （enteric nervoussystem ， ENS） 受到刺激、绒毛缺血。 多种细胞因子参与作用等均参与了轮状病毒腹泻的发病机制。

材料与仪器

器材：猪和犬
试剂：Hp 菌液 （10
6
－10
9
CFU/0.2 ml）

步骤

轮状病毒感染动物模型的基本过程可分为如下几步：
A. 病毒培养：选择猴肾 MA104 细胞 （非洲绿猴胎肾细胞传代细胞系） 细胞生长于含 10％ 新生牛血清的高糖培养基 （IDMEM）。细胞成单层后用 Hanks 液洗涤 3 次， 然后加人经 10 U/ml 胰蛋白酶预处理的轮状病毒 SA11，37 ℃ 吸附 60 分钟， 弃上清液， 加含 1 U/ml 的胰蛋白酶， 继而在无牛血清的 DMEM 液静止培养 （37 ℃，59％ CO）。 待细胞病变明显后收取细胞培养物。
B. 病毒浓缩：
方法一， 细胞培养物经 3 次冻融，4 ℃ 3000 xg 离心 30 分钟， 弃沉淀， 取上清液分装，100000 xg 离心 3 小时， 沉淀加磷酸盐缓冲液 （PBS），－70 ℃ 冻存备用。采用空斑形成法滴定病毒的感染滴度， 待病毒滴度达到 10' 空斑形成单位 （plaque forming unit ， PFUYml 时进行动物实验。
方法二、MA104 细胞感染 48 小时后， 收集细胞和上清， 反复冻融 3 次后， 超滤浓缩病毒， 取 10＇PFU 病毒经口感染动物。
C. 病毒感染：选择清洁级健康孕鼠， 检测其轮状病毒抗原为阴性， 待孕鼠自然分娩后， 自然母乳喂养， 第 4 天用改良的 1 ml 注射器经口灌服 5x10＇PFU 猴轮状病毒 SA11 病毒悬液， 以后正常喂养。
D. 临床观察及动物粪便样品收集： 乳鼠感染 SA11 后， 对其进行连续的临床观察， 收集乳鼠粪便样本。每隔 12 小时观察 1 次， 每次用手指轻轻按摩乳鼠腹部， 观察腹泻产生情况， 腹泻的判断参照文献分为 6 级，1 级为无便。2 级为黄色成形便，3 级为黄色糊状便，4 级为黄色水样黏液便，5 级为黄色蛋汤样便，6 级为完全黄色水样便。3 级 （黄色糊状便） 及以上为腹泻，4～5 级为轻度腹泻，6 级为重度腹泻。腹泻的判断由同一人完成。
E. RV 抗原检测： 取适量粪便样品放人容器内， 加入 9 倍体积等渗盐水， 搅拌混匀 2 分钟， 静置或离心后， 用 A 群轮状病毒诊断试剂盒检测。
F. 小肠组织光镜及电镜观察： 分别在病毒攻击后的第 4 天用颈椎脱臼法随机处死每小组 2 只乳鼠。 剪取空肠段约 1 cm 制作样本， 作病理组织学诊断和透射电子显微镜下观察并拍照。
G. 小肠绒毛高度测量： 每小组各取 2 只乳鼠， 每只取空肠石蜡切片 4 张， 共 8 张。苏木素Ⅰ伊红 （HE） 染色后， 光学显微镜下照相， 专业图像分析软件测量其中所有绒毛高度， 测量参照长度为血细胞计数板计数池标记线。

如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

https://www.aladdin-e.com