本技术主要应用于激素类兴奋剂的检测。

操作方法

绿色荧光蛋白融合技术

原理

重组人生长激素（rhGH）与胰岛素生长因子-1（ICF-Ⅰ）是目前运动员滥用严而又难以检测的内源性激素类兴奋剂。以IGF-Ⅰ作为目标分析物，利用分子生物学方法构建绿色荧光蛋白（GFP）与IGF-Ⅰ的融合蛋白GFP-IGF。GFP是目前应用广泛的一种生物报告分子，具有稳定、无毒害、无需底物和辅助因子即可自发荧光等特性，是一种极具潜力的标记物。

材料与仪器

蛋白质
绿色荧光蛋白 融合蛋白
PCR仪 电泳槽 荧光显微镜

步骤

1. 通过基因重组，构建表达融合蛋白GFP-IGF的大肠杆菌重组菌。

2. 纯化融合蛋白，经SDS-PAGE分析为单一条带，分子量36KD。

3. Western印迹与ELISA，验证融合蛋白能特异性地与IGF-1抗体反应，具有IGF-1的抗原性。

4. 表面等离子体共振（SPR）分析，得到GFP-IGF与IGF-1单抗的KD=2.6X10^-8M，符合免疫的要求。

5. CD光谱、荧光光谱、荧光寿命分析表明融合蛋白保持了GFP的荧光特性。

注意事项

1. 注意分子操作的规范。

2. 蛋白纯化应在低温进行。

常见问题

来源：《绿色荧光蛋白融合技术在激素类兴奋剂检测中的应用》

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