SBFI AM 钠离子荧光指示探针简介与应用概述

         SBFI，全名Sodium-binding Benzofuran Isophthalate，是一种Na⁺选择性荧光指示剂，可用于评估纯化线粒体Na⁺ 梯度、检测胞内Na⁺水平、测定细胞Na⁺外流，以及与其他荧光指示剂联合使用，分析Na⁺与Ca²⁺、Mg²⁺浓度、胞内pH和膜电位变化之间的相关性。

         虽然SBFI对Na⁺的亲和力（Kd）低于典型Ca²⁺指示剂（如Fura-2对Ca²⁺的亲和力），但在存在其他单价阳离子的体系中，SBFI仍足以检测Na⁺的生理浓度。Na⁺结合后，SBFI的激发光谱发生变化，可通过340/380 nm激发比率测定进行判定，并可与使用相同滤光片和仪器检测的探针Fura-2联合使用。

         在含有生理浓度K⁺/Na⁺（约 135 mM）的体系中，SBFI对Na⁺的解离常数（Kd）约为11.3 mM；在无K⁺的体系中，对Na⁺的 Kd约为3.8 mM。SBFI对Na⁺的选择性约为对K⁺的18倍。

         在实际应用中，常用的为SBFI的AM酯形式（SBFI AM）而不是游离型SBFI。游离型SBFI带有电荷，不能自由穿透细胞膜，如需用于细胞内Na⁺检测，必须通过显微注射、电穿孔或其他转运手段导入，操作复杂且重复性较差；而SBFI AM通过引入乙酰氧基甲基（AM）基团，暂时屏蔽了电荷，呈中性、脂溶性，可被动穿透细胞膜进入胞内。进入细胞后，细胞内酯酶会逐步水解AM基团（即下述“酯酶水解孵育”步骤），重新生成带电荷的游离型SBFI，使其滞留在胞内并恢复对Na⁺的荧光响应能力。因此，实验中先使用易透膜的SBFI AM形式进行加载，再通过酯酶水解释放出游离型SBFI，是实现细胞内稳定、可重复Na⁺成像的关键步骤。

产品理化性质及储存条件

         本品为乙酰氧基甲基酯（Acetoxymethyl ester, AM ester）形式的SBFI，CAS号：129423-53-6，具有细胞膜渗透性，只需简单孵育即可进入细胞。常用加载浓度范围为5–10 µM，加载时间40 min–4 h，可根据具体的实验要求和细胞类型进行调整。

1. 理化性质

1）化学名：4,4’-[1,4,10-trioxa-7,13-diazacyclopentadecane-7,13-diylbis(5-methoxy-6,2-benzofurandiyl)]bis-1,3-benzenedicarboxylic acid 1,1’,3,3’-tetrakis[(acetyloxy)methyl] ester

2）同义名：Sodium-binding Benzofuran Isophthalate Acetoxymethyl ester

3）CAS 号：129423-53-6

4）分子式：C₅₆H₅₈N₂O₂₃

5）分子量：1127.07

6）Ex/Em：340, 380 / 500 nm

7）外观：浅黄至暗黄至暗橙色固体或油状物

8）溶解性：溶于DMSO（10 mM）

2. 保存与运输

(a) 保存：-20 ℃ 避光、干燥条件下冻存，稳定期两年。

(b) 运输：冰袋运输。

SBFI AM工作液配制及细胞内Na⁺成像实验流程

         以下步骤仅作参考，具体条件请根据实际情况或相关文献进行优化和调整。

1）SBFI AM 储备液的配制

配置1–10 mM SBFI AM储备液。例如：实验前取一管50 µg SBFI AM，于室温回温至少20 min，低速离心收集粉末后，加入8.8723 µL 无水DMSO使其充分溶解，即可制备5 mM储备液。若单次用不完，应分装后冻存保存。

2）25%（w/v）Pluronic F-127的配制

取100 mg Pluronic F-127 粉末，加入400 µL DMSO，配制成25%（w/v）Pluronic F-127 DMSO 母液。溶解过程可在40–50 ℃ 加热20–30 min。溶液可室温保存，无需冷藏。如有结晶析出，可再次加热溶解，不影响使用。（亦可配制其他浓度的 Pluronic F-127，只需保证最终工作体系内 Pluronic F-127 < 0.1%（w/v）。）

3）SBFI AM与Pluronic F-127的预混

在正式实验前，将SBFI AM 储备液与等体积 25%（w/v）Pluronic F-127 充分混匀。

注意：SBFI AM 水溶性差，必须借助Pluronic F-127促进其分散并进入水相加载缓冲液。两者应在实验前现配现用，不宜预先混合后长期保存。

4）工作液及细胞加载

将上述混合液加入适量细胞加载缓冲液（如生理缓冲液PBS、无血清细胞培养基等），配制成所需工作浓度，然后加入细胞进行探针标记。孵育温度可为室温或37 ℃，孵育浓度通常为5–10 µM，时间40 min–4 h。具体孵育浓度和时间请参考相关文献并结合不同细胞类型进行优化。

5）酯酶水解孵育

孵育结束后，更换为不含探针的细胞加载缓冲液，额外孵育20–60 min，以保证细胞内酯酶能充分水解SBFI AM的 AM基团，生成游离型SBFI。

6）洗涤

使用生理缓冲液或无血清培养基清洗细胞至少一次，以降低胞外背景荧光。

7）荧光检测

使用合适的荧光检测仪器采集信号，分别在激发波长 340 nm 和 380 nm、发射波长 500 nm（可在 450–550 nm 范围内根据实际情况选择）条件下收集荧光信号。通过340/380 nm激发比值变化来推算Na⁺浓度。

【补充注意事项】

1）若细胞加载缓冲液以碳酸氢钠为缓冲体系，加载过程需在含5% CO₂的环境中进行，以防CO₂损失引起缓冲液碱化。

2）若细胞加载缓冲液中含血清，需适当提高AM探针工作浓度，以补偿因AM探针与血清蛋白结合造成的有效浓度下降。

3）对于分子量接近或超过1000的AM探针，通常需要在不含探针的细胞加载缓冲液中进一步孵育20–60 min，以保证细胞内酯酶能充分降解AM基团。

4）探针的加载时间和浓度会因细胞类型不同而存在差异，请在使用前参考相应文献并进行条件摸索。

5）探针在细胞内的有效Kd与溶液中的Kd存在差异，SBFI的胞内Kd可借助通道形成抗生素（如 gramicidin）进行校准（calibration），根据具体实验需求决定是否进行该步骤。

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参考文献：

a) Negulescu PA et al. Intracellular ion activities and membrane transport in parietal cells measured with fluorescent dyes. Methods Enzymol. 1990;192:38-81.

b) Harootunian et al. Ratio imaging using a newly developed fluorescent sodium indicator in rat fibroblasts. FASEB J 2:A728 (1988).

c) Harootunian et al. Fluorescent ratio imaging of cytosolic free Na⁺ in fibroblasts and lymphocytes. J Biol Chem. 1989.

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