阶段1   脱蜡和抗原修复

• Ventana Ultra

所需材料

IHC试剂

       - 二甲苯

       - 乙醇

       - HIER抗原修复通用试剂

设备

       - Leica ST5020 Multistainer

       - BioCare Medical Decloaking Chamber™ Plus

实验步骤

1.在Leica ST5020 Multistainer仪器上按照以下程序在进行样本烘烤和脱蜡：

       • 3 × 3分钟，二甲苯

       • 2 × 2分钟，100%乙醇

       • 1 × 1分钟，95%乙醇

       • 1 × 1分钟，70%乙醇

       • 1 × 3分钟，PBS处理

       • 65°C烘烤10分钟

2.使用HIER抗原修复通用试剂在110°C下利用BioCare Medical Decloaking Chamber™ Plus 进行抗原修复10分钟。

Dako Omnis

所需材料

        - 一抗：抗PD-L1抗体

        - Clearify清除剂

        - 去离子水

        - EnVision FLEX TRS，低pH值

实验步骤

1.脱蜡。

阶段1：

阶段2：

2.抗原修复（去遮蔽）。

第 2 阶段   IHC染色

• Leica BOND RX 

所需材料

IHC 试剂

        - Bond™ 脱蜡溶液

        - Bond™ 表位修复1（ER1）

        - Bond™ 清洗液

        - Bond™ Polymer Refine Detection试剂盒

        -常用抗体稀释剂

        -抗PD-L1抗体

        -同型对照抗体，以兔单克隆抗体为例

设备

         - Leica BOND RX Autostainer

实验步骤

1.在Leica BOND RX自动染色机上加热并脱蜡。

2.在Leica BOND RX Autostainer使用ER1（Leica的Citra缓冲液，pH6）进行抗原修复，100°C，30分钟。

3.使用过氧化物酶阻断剂（Bond™ Polymer Refine Detection 试剂盒）孵育10分钟，然后用洗涤缓冲液冲洗3次。

4.将稀释的抗体涂在载玻片上，并在室温下孵育1小时。

5.用洗涤缓冲液洗涤3次。

6.将一抗后封闭液（Bond™ Polymer Refine Detection 试剂盒）添加到载玻片上并孵育30分钟。

7.用洗涤缓冲液洗涤3次。

8.将NovoLink聚合物（Refine Kit）添加到载玻片上并孵育30分钟。

9.用洗涤缓冲液洗涤3次。

10.加入DAB显色底物（Refine Kit）并显色10分钟。

11.室温下用dH2O清洗载玻片5次。

12.室温下用苏木精（Refine Kit）复染8分钟。

13.室温下用dH2O清洗载玻片5次。

• Ventana Ultra

所需材料

IHC试剂

         - 抗体稀释剂

         - ChromoMap DAB试剂盒

         - 抗兔HQ

         - 抗HQ HRP

         - 苏木精II

         - 蓝化试剂

         - 抗PD-L1抗体

设备

         - Ventana Ultra

实验步骤

1 .将载玻片装载到Ventana Ultra上。

2 .选择-抗体。

3 .选择-一抗手动应用。

4.将载玻片从低温升温至37°C（一抗）。

5.手动加入一抗并孵育60分钟。

6.选择-连接抗体。

7.选择-二抗。

8.将载玻片从低温升温至37°C（第二抗体）。

9.滴加一滴高质量抗兔二抗（Detection #1）并孵育16分钟。

10 .选择-酶结合物。

11.滴加一滴Anti-HQ HRP（结合物 #1）并孵育16分钟。

12.选择-DAB。

13.选择——复染。

14.选择-使用RB进行复染。

15.滴加一滴苏木精II（复染剂）并孵育8分钟。

16.选择-后复染。

17.选择-使用RB进行后复染。

18.滴一滴蓝化试剂（后复染）并孵育4分钟。

• Dako Omnis

所需材料

          - 一抗：PD-L1抗体

          - 洗涤缓冲液

          - EnV FLEX过氧化物酶阻断试剂

          - EnV FLEX + Rabbit Linker

          - 标记聚合物 EnV FLEX/HRP

          - EnV FLEX底物工作液

          - 苏木精

          - 去离子水

实验步骤

1.用洗涤缓冲液洗涤2次，每次2分40秒。

2.将一抗（PD-L1，1:400）孵育1小时。

3.用洗涤缓冲液洗涤10次，每次2分钟。

4.内源性酶阻断。用EnV FLEX过氧化物酶阻断试剂阻断3分钟。

5.用洗涤缓冲液洗涤10次，每次2分钟。

6.将二抗（EnV FLEX + Rabbit Linker）孵育10分钟。

7.用洗涤缓冲液洗涤10 × 2分钟。

8.将标记的聚合物（FLEX/HRP）孵育20分钟。

9.清洗。

          • 10 × 2分钟，洗涤缓冲液

          • 10 × 2分钟，洗涤缓冲液

          • 1 × 31秒，去离子水

          • 10 × 2分钟，洗涤缓冲液

10.将底物-发色团（EnV FLEX 底物工作溶液）孵育5分钟。

11.清洗。

          • 10 × 2分钟，洗涤缓冲液

          • 1 ×31秒，去离子水

          • 10 × 2分钟，使用洗涤缓冲液

12.与复染剂（苏木精）一起孵育3分钟。

13.洗涤。

          • 10 × 2分钟，洗涤缓冲液

          • 10 × 2分钟，洗涤缓冲液

第 3 阶段   脱水和盖片

• Leica BOND RX 

所需材料

IHC试剂

          -乙醇

          -二甲苯

          - Cytoseal封片剂

设备

          - Leica ST5020 Multistainer

          - BioGenex i6000 Autostainer

          - Leica Auto Coverslipper CV5030

实验步骤

1.从Leica BOND RX自动染色机中取出载玻片。

2 .将载玻片安装到Leica ST5020 Multistainer上。

3.用乙醇脱水。

          • 用70%乙醇清洗1次，每次2分钟

          • 用95%乙醇清洗1次，每次2分钟

          • 用100%乙醇清洗2次，每次2分钟

4.用二甲苯清洗2次，每次2分钟。

5.将带有 Cytoseal封片剂的盖玻片放入Leica Auto Coverslipper CV5030中。

• Ventana Ultra

所需材料

IHC试剂

          -二甲苯

          -乙醇

          -去离子水

          - Cytoseal封片剂

设备

          - Ventana Ultra

          - Leica ST5020 Multistainer

实验步骤

1 .从Ventana Ultra中取出载玻片。

2.先用肥皂清洗载玻片，再用去离子水冲洗。

3.在Leica ST5020 Multistainer上安装载玻片并使用以下程序。

          • 用70%乙醇脱水2分钟

          • 95%乙醇处理2分钟

          • 100% 乙醇处理，3 × 2分钟

          • 用二甲苯冲洗3次，每次2分钟

4.用Cytoseal封片剂盖玻片手动封片。

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