β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）操作规程与使用方法
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）操作规程与使用方法
β-Nicotinamide adenine dinucleotide(NAD) is a fundamental redox coenzyme present in all living cells, serving as an essential hydride-transfer cofactor in hundreds of oxidoreductase reactions and as a critical substrate for signaling enzymes including sirtuins and PARPs.（β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是存在于所有生物细胞中的基础氧化还原辅酶，是数百种氧化还原酶反应中不可或缺的氢负离子转移辅因子，也是包括去乙酰化酶（Sirtuins）和多聚ADP核糖聚合酶（PARPs）在内的信号传导酶的关键底物。）
- 化学名称
- β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化型，NAD⁺）
- 产品编号
- N1492518
- 分子量
- 663.43 g/mol（游离酸）
- 推荐储存条件
- –20 °C，干燥避光保存，避免反复冻融
- 典型溶解度
- 可自由溶于水（≥50 mg/mL）；溶解后调节pH至7.0–7.5
- 紫外吸收
- NAD⁺在260 nm处有吸收；NADH还在340 nm处有吸收（ε ≈ 6,220 M⁻¹cm⁻¹）
材料与试剂
在开始任何基于NAD的实验方案之前，请准备以下材料：
- β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺） — Aladdin产品编号 N1492518
- 超纯水（18.2 MΩ·cm）或适合您实验的缓冲液（如50 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM磷酸缓冲液pH 7.4）
- 分析天平（±0.1 mg）
- 低吸附微量离心管（1.5 mL）
- pH计或精密pH试纸
- 紫外-可见分光光度计（用于在260 nm和340 nm处验证纯度）
- 冰桶及干冰或液氮（用于短期操作）
- 0.22 µm注射器过滤器（可选，用于储存液的无菌过滤）
注意：所有步骤应尽可能在冰上或4 °C条件下进行，以最大限度减少糖苷键的水解。
储存液的配制
请按照以下步骤配制稳定的NAD⁺储存液：
- 恢复至室温：在开封前，将密封小瓶（N1492518）在室温下平衡约20分钟，防止冷凝水进入粉末。
- 精确称量：将低吸附离心管去皮后，转入所需质量的NAD⁺粉末。若需配制1 mL 10 mM储存液，称取约6.63 mg。
- 溶解：加入目标体积80%的超纯水或缓冲液，轻轻涡旋（5–10秒）至完全溶解。NAD⁺溶解性好，避免长时间涡旋。
- 调节pH：用校准的微型电极检测pH值，如有必要，逐滴加入0.1 M NaOH，将pH调至7.0–7.5。酸性pH会加速水解；碱性pH（>8）会导致还原伪影。
- 定容：用超纯水或缓冲液补足至目标终体积。
- 验证纯度（可选但推荐）：测量260 nm处的吸光度，利用比尔-朗伯定律计算浓度（NAD⁺的ε₂₆₀ ≈ 17,800 M⁻¹cm⁻¹）。纯品NAD⁺的A₂₆₀/A₂₈₀比值应>2.0。
- 分装储存：分装为单次用量，在液氮中速冻，于–20 °C保存（最长6个月）或–80 °C保存（最长1年），避免反复冻融。
注意：NAD⁺水溶液在室温下不稳定；若怀疑已降解（溶液变黄或无酶反应时A₃₄₀增加），应重新配制新鲜分装液。
NAD⁺/NADH酶促循环测定实验方案
酶促循环测定法是一种灵敏的比色法，用于定量总NAD（NAD⁺+NADH）或在选择性分解另一种形式后分别定量各组分。
原理
在乙醇存在下，NAD⁺被乙醇脱氢酶（ADH）还原为NADH。NADH随后通过吩嗪甲硫酸酯（PMS）将四唑染料（如MTT或WST-1）还原，生成可在570 nm（MTT）或450 nm（WST-1）处检测的有色甲臜，信号强度与NAD浓度成正比。
操作步骤
- 配制提取缓冲液（例如，检测NAD⁺使用0.2 M高氯酸，检测NADH使用0.2 M KOH）。在冰上将样品（细胞或组织）均质化于200 µL提取缓冲液中。
- 于4 °C以14,000 × g离心5分钟，收集上清液。
- 对于NAD⁺检测，用1 M K₂HPO₄中和酸性提取液；对于NADH检测，用1 M KH₂PO₄中和碱性提取液。再次离心去除沉淀。
- 在96孔板中设置循环反应：
— 100 µL循环缓冲液（0.1 M Tris-HCl pH 8.0、0.5 mM MTT、2 mM PMS、10 mM乙醇、0.2 U/mL ADH）
— 10 µL样品提取液或NAD⁺标准品（由N1492518储存液配制，浓度范围0–200 µM） - 于37 °C避光孵育30分钟。
- 加入20 µL 1 M HCl终止反应。
- 用酶标仪在570 nm处读取吸光度。
- 根据标准曲线计算NAD⁺浓度，以蛋白含量（Bradford或BCA法）进行归一化。
注意：每块板均应设置无NAD空白对照和已知浓度标准品，以校正本底和加样误差。
常见问题排查与质量控制
| 现象 | 可能原因 | 纠正措施 |
|---|---|---|
| 570 nm处吸光度信号低或无信号 | NAD⁺储存液降解；ADH失活；pH不正确 | 用N1492518重新配制新鲜储存液；用阳性对照验证酶活性；确认测定缓冲液pH为7.5–8.0 |
| 空白孔本底偏高 | 试剂中存在NADH污染；MTT/PMS暴露于光照 | 新鲜配制试剂；孵育期间用铝箔包裹96孔板 |
| 标准曲线非线性 | 高浓度时底物耗尽；加样误差 | 缩短循环时间或稀释高浓度标准品；使用经校准的移液器 |
| 平行样间结果重现性差 | NAD⁺分装液反复冻融 | 使用单次用量分装液；4 °C下融化后的储存液24小时内用完并丢弃 |
| NAD⁺粉末或溶液出现黄色变色 | 氧化或水解降解 | 丢弃该批次；向Aladdin索取质量检验报告（CoA）；替换品在–20 °C加干燥剂保存 |
常见问题
如何从Aladdin N1492518配制稳定的NAD⁺储存液？
将粉末溶于超纯水或中性缓冲液（pH 7.0–7.5），在冰上操作，分装为单次用量，在液氮中速冻后于–20 °C或–80 °C保存。避免反复冻融，因为高温和酸性条件会加速NAD⁺的水解。
使用前如何验证NAD⁺溶液的纯度和浓度？
使用分光光度计测量260 nm处的紫外吸光度，利用比尔-朗伯定律计算浓度（ε₂₆₀ ≈ 17,800 M⁻¹cm⁻¹）。纯品NAD⁺的A₂₆₀/A₂₈₀比值应>2.0。若在无酶反应的情况下A₃₄₀异常升高，则提示存在NADH污染或还原伪影。
为什么我的NAD⁺溶液变黄，还能继续使用吗？
黄色变色表明烟酰胺环发生了氧化或水解降解，产生了有色副产物。降解的NAD⁺不应用于定量测定，否则会低估功能性NAD⁺浓度，并在以NADH为读数的实验中产生假本底信号。请从N1492518的新分装液重新配制储存液。
NAD⁺（N1492518）可以用作去乙酰化酶活性测定的底物吗？
可以。去乙酰化酶（NAD⁺依赖性脱酰基酶）在催化过程中按化学计量消耗NAD⁺，产生烟酰胺和O-乙酰基-ADP-核糖。N1492518的NAD⁺适合作为辅底物使用，前提是溶液新鲜配制且pH维持在7.5–8.0。请参考相关文献确认具体实验所需的NAD⁺浓度。
NAD⁺和NADH有什么区别？Aladdin两者都供应吗？
NAD⁺是二核苷酸辅酶的氧化型，接受氢负离子后转变为NADH（还原型）。在测定实验中，NAD⁺作为脱氢酶的氧化底物，而NADH则用于需要还原型辅因子的场合。Aladdin产品编号N1492518提供氧化型（NAD⁺）；如需NADH或其他NAD相关产品，请查阅Aladdin产品目录。
参考文献
- Berger F, Ramírez-Hernández MH, Ziegler M. The new life of a centenarian: signalling functions of NAD(P). Trends Biochem Sci. 2004;29(3):111-118. doi:10.1016/j.tibs.2004.01.007
- Harden A, Young WJ. The alcoholic ferment of yeast-juice. Proc R Soc Lond B. 1906;77:405-420.
- Garland PB. Energy transduction and transmission in microbial systems. Symp Soc Gen Microbiol. 1977;27:1-21.
- Imai S, Guarente L. NAD⁺ and sirtuins in aging and disease. Trends Cell Biol. 2014;24(8):464-471. doi:10.1016/j.tcb.2014.04.002
产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。
危险品化学品经营许可证（带存储）