一、概述与原理

        生物素化（Biotinylation）是将生物素以共价键连接到氨基酸残基或蛋白质上的过程。由于生物素分子体积小、化学性质稳定，通常不显著干扰蛋白的结构与功能。生物素与亲和素（Avidin）或链霉亲和素（Streptavidin）之间具有极高亲和力（Ka≈10¹⁵ M⁻¹）、快速结合动力学和高度特异性，因此生物素标记蛋白被广泛用作生物技术和生物医学研究中的分子工具。

        将亲和素或链霉亲和素偶联到层析填料上，利用其与生物素之间的特异性结合，将生物素标记的蛋白从含有大量杂蛋白/杂质的溶液中选择性捕获。通常，亲和素/链霉亲和素与生物素的结合极为牢固，仅在强变性或极端条件下才可将生物素标记分子从填料上洗脱。

二、亲和素与链霉亲和素的比较

          亲和素（Avidin）：糖蛋白，分子量约67 kDa，由四个同源亚基组成，每个亚基含一个生物素结合位点，总糖含量约占分子量的10%。每个亚基对生物素具有极高的亲和力（Ka≈10¹⁵ M⁻¹）。

          链霉亲和素（Streptavidin）：同样为四聚体蛋白，分子量约60 kDa，不含糖链。与亲和素相比，缺乏碳水化合物侧链，因而非特异性吸附更低；对生物素的结合亲和力与亲和素相当。

三、重力柱纯化生物素标记分子

【适用场景】

直接从含有杂蛋白/杂质的样品中纯化生物素标记的蛋白、抗体或其他生物分子。

【所需试剂】

亲和素或链霉亲和素填料

结合/洗杂缓冲液：1×PBS（pH7.2–7.4）

洗脱缓冲液：8 M盐酸胍，pH 1.5

【操作步骤】

①将亲和素或链霉亲和素填料装入重力柱中，以≥5倍填料体积的1×PBS对填料进行平衡。

②将生物素标记的抗体、蛋白或其他生物分子样品上柱，流速无需过快，以确保充分接触。

③以≥10倍填料体积的1×PBS洗杂，去除未结合或非特异性结合组分。

④以5–10倍填料体积的8 M盐酸胍（pH 1.5）进行洗脱，分管收集洗脱液，后续根据下游应用进行适当中和及缓冲液置换。

四、利用生物素标记分子制备亲和填料

【适用场景】

将生物素标记的抗体或配体固定于亲和素/链霉亲和素填料上，制备专一性亲和柱，用于后续靶标蛋白或相互作用分子的富集与纯化。

【所需试剂】

亲和素或链霉亲和素填料

生物素标记的抗体、蛋白或其他配体分子

结合/洗杂缓冲液：1×PBS

洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 2.8

中和缓冲液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

【操作步骤】

①将亲和素或链霉亲和素填料装入重力柱中，以≥5倍填料体积的1×PBS平衡填料。

②将生物素标记抗体、蛋白或其他配体上柱，结合流速不必过快，以确保完全结合。

③以≥10倍填料体积的1×PBS洗杂，去除未结合及非特异性吸附组分，此时生物素标记配体已被牢固固定在填料上，亲和填料制备完成。

④将含有与该生物素标记配体发生特异性相互作用的样品上柱，控制较慢流速以利于结合。

⑤以≥10倍填料体积的1×PBS洗杂，除去未结合及非特异性结合组分。

⑥以5–10倍填料体积的0.1 M甘氨酸（pH 2.8）进行洗脱，收集洗脱级分，并立即向每管中加入1/10体积的1 M Tris-HCl（pH 8.5）进行中和。

⑦洗脱结束后，以约10倍填料体积的1×PBS再次平衡填料，加入终浓度约0.02%叠氮化钠，4℃保存，以备重复使用。

五、免疫沉淀/Pull-Down实验

【适用场景】                             

利用生物素标记抗体或捕获蛋白在离心管中富集目标分子或其相互作用蛋白复合物。

【所需试剂】

生物素标记的抗体、蛋白或其他捕获分子

亲和素或链霉亲和素填料（悬浮液）

结合/洗杂缓冲液：1×PBS

洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 2.8

中和缓冲液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

【操作步骤】

①在1.5 mL或2 mL离心管中，用50–100 μL结合缓冲液溶解或稀释抗原或含待捕获蛋白的样品。

②向样品中加入适量生物素标记抗体或捕获蛋白，充分混匀。

③置4℃条件下缓慢旋转或轻柔振荡孵育过夜，使抗原与生物素标记抗体/捕获蛋白结合。

④加入适量亲和素或链霉亲和素填料悬液，于室温或4℃下轻柔振荡孵育≥1 h，形成“抗原–生物素标记分子–亲和素/链霉亲和素填料”复合物。

⑤以约2 000×g离心2 min，弃上清。

⑥加入约1 mL 1×PBS重悬填料，再次离心弃上清；重复洗杂步骤至少4次，以充分去除非特异结合蛋白。

⑦加入0.5–1 mL 0.1 M甘氨酸（pH 2.8）重悬填料，短暂孵育后离心收集上清，立即向洗脱液中加入1/10体积的1 M Tris-HCl（pH 8.5）中和，获得富集的目标蛋白或复合物。

六、填料清洗与维护

随着使用次数增加，非特异性吸附和蛋白聚集可导致流速下降和结合能力降低，此时需对填料进行清洗。

1）去除沉淀或变性蛋白

①用约2倍柱体积的0.1 M NaOH或6 M盐酸胍或8 M尿素溶液清洗柱床。

②立即用≥5倍柱体积的1×PBS（pH7.4）冲洗，除去残留强变性剂或碱液。

③强变性或强碱清洗可能影响配基活性，应根据填料说明书和实际耐受条件谨慎选择。

2）去除疏水性非特异吸附物质

①使用3–4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1%Triton X-100溶液清洗。

②随后立即以≥5倍柱体积的1×PBS（pH 7.4）充分冲洗，去除残留乙醇或去污剂。

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