改编自 S.W. Gersting 等人（2012年）

引言

生物过程是复杂的，由称为“互作组网络”的相互作用网络决定，这些网络包括蛋白-蛋白相互作用。蛋白质互作组是细胞功能的基本组成部分，但我们对它的理解仍不完全。其中一种有助于我们绘制这一互作组图谱的实验方法是生物发光共振能量转移（BRET）实验。

BRET最初是为研究昼夜节律蛋白之间的相互作用而开发的，它可以用于在活细胞中以生物发光的方式实时监测蛋白-蛋白相互作用。在该实验中，将一个目标蛋白与一个能量供体蛋白（即生物发光酶）融合，另一个目标蛋白与一个能量受体蛋白（即荧光蛋白）融合。这两个融合蛋白复合体在细胞内共同表达。当向细胞中加入供体蛋白的底物时，若两个目标蛋白发生相互作用，供体蛋白被氧化并将能量转移给受体蛋白，随后受体蛋白释放出可检测的荧光信号（见图1）。

该实验方法存在多个版本。本文描述的是第一代BRET方法的实验步骤，其中Renilla荧光素酶（Rluc）作为供体蛋白，YFP（黄色荧光蛋白）作为受体蛋白。此外，Coelenterazine 或 Coelenterazine 400a 被用作Rluc的特异性底物（即供体蛋白的底物）。

材料

细胞培养

1、PMI 1640 培养基（含L-谷氨酰胺和酚红，Aladdin 目录号：P432098），补充以下成分：

• 10% 胎牛血清（FBS）
• 1% 抗生素-抗真菌溶液，含：
• 100 U/ml 青霉素（Aladdin 目录号：P274325）
• 0.1 mg/ml 链霉素（Aladdin products）
• 0.25 µg/ml 两性霉素B（Aladdin 目录号：A657418）

2、胰酶-EDTA消化液：0.125% 胰酶（Aladdin products）和 0.05% EDTA（Aladdin 目录号：E118595）混合溶液

3、Dulbecco’s PBS缓冲液（1×）：无钙、无镁（Aladdin 目录号：P755553）。每片PBS片剂可配制100 ml 1× PBS工作液。

4、 细胞培养容器

5、 COS7细胞

转染

· 96孔电穿孔系统

· 电穿孔缓冲液和电穿孔比色杯

· 白壁、透明底、组织培养处理的96孔板

· 含L-谷氨酰胺但不含酚红的RPMI 1640培养基，补充有10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液，包含：

• 100 U/ml 青霉素（Aladdin 目录号 P274325）
• 0.1 mg/ml 链霉素（Aladdin products）
• 0.25 µg/ml 两性霉素B（Aladdin 目录号 A657418）

· 质粒：

• BRET表达构建体：基于真核表达质粒构建，分别将目标蛋白的N端或C端与Rluc或YFP融合。
• 编码YFP-Rluc融合蛋白的质粒（阳性对照）
• 仅编码YFP的质粒（用于校正因子）

BRET信号检测

• 原型辅酶素 Coelenterazine（包括 Coelenterazine（Aladdin 目录号  C131248）或 Coelenterazine 400a（Aladdin 目录号 C332017）），溶解于甲醇中（1 mg/ml），分装并在 -80°C 下保存以保持长期稳定性。需避光保存。
• Renilla 荧光素酶检测缓冲液，成分如下：NaCl 64.28 g/L，Na₂EDTA（Aladdin 目录号 E118595）0.82 g/L，KH₂PO₄ 29.92 g/L，BSA（Aladdin 目录号 B754973）0.44 g/L。经无菌过滤后，于4°C保存。
• Dulbecco’s PBS缓冲液（1×），不含钙和镁（Aladdin 目录号 P397924）。
• 发光多孔板检测仪，配备双滤光器，可同时检测Rluc（475 ± 30 nm）和YFP（535 ± 30 nm）的发射信号。

实验方法

使用96孔电穿孔系统进行高效大规模细胞转染

细胞培养

1. 为准备足够数量的细胞，在培养容器中以单层方式培养COS7细胞。向每个容器中接种一千万个COS7细胞，并在RPMI 1640培养基中于37°C、5% CO₂条件下培养1周。
注意： BRET实验可适用于所有原代及稳定表达的贴壁和悬浮细胞系，便于实现高效转染及高表达的BRET构建体。
注意： 每种细胞系的转染条件需单独优化。对于与本协议中使用的COS7细胞不同来源的COS7细胞，也可能需要重新优化电转染条件。

2. 在转染当天，通过胰酶消化法使细胞脱附，并使用常规Neubauer计数板计算细胞数量。通常可收获总共2.4亿个COS7细胞。
注意： COS7细胞最多传代20次后用于转染。

转染

1. 电穿孔转染使用96孔核转染设备，可实现高效转染及适当的通量。
注意： 推荐使用高效率的转染系统。电穿孔技术已被证明对多种细胞系具有80-90%的转染效率。然而，其他转染方法也可能同样有效。需要注意的是，对于96孔活细胞BRET测量，至少约50%的转染效率是必要的。

2. 每孔加入2 × 10⁵个COS7细胞、1 µg质粒DNA和20 µl 96孔核转染试剂。

3. 为分析二元蛋白-蛋白相互作用，通过BRET共同转染编码目标蛋白的BRET表达载体，受体蛋白（YFP）与供体蛋白（Rluc）的构建体比例为3:1。
注意： 在研究二元蛋白-蛋白相互作用时，增加带有YFP标签蛋白与Rluc标签蛋白的比例可导致BRET比值呈双曲线变化。当所有供体蛋白饱和能量受体时将达到平台期（BRETmax）。相比之下，如果是由于随机碰撞造成的非特异性相互作用，“旁观者”型BRET信号会随受体/供体比例增加而近似线性上升。因此，BRET饱和实验是区分真实阳性与假阳性相互作用的有力工具。通过YFP与Rluc比例在BRET半饱和值（BRET50）下的值可确定相对结合亲和力指数。

4. 每对蛋白重复测试两次，并进行两次独立实验。
注意： 蛋白标签的方向（N端或C端）可能影响BRET信号或蛋白间相互作用。本实验通过改变目标蛋白的N端和C端融合构建体的方式来规避这一问题，从而为每对蛋白提供8种可能的标签组合。

5. 每块板应进行多个对照实验（三次重复）。YFP-Rluc融合蛋白质粒作为阳性对照，在实验中应具有一致的信号（~1.0）。作为设备特异性阴性对照，与YFP构建体共同转染一个表达Rluc标签目标蛋白的构建体（但缺少目标蛋白）。测得的BRET比值可用作校正因子（cf），从所有BRET实验中减去该值。此处，受体通道（535 nm）检测到的光发射主要来自供体通道滤光片穿透的信号。此外，还需设置非转染细胞的背景对照，以确保实验条件的稳定性。

6. 在无菌的96孔V型底板或常规无菌PCR管中制备DNA，每孔加入0.65 µg供体构建体DNA和1.95 µg受体构建体DNA（分别为0.25和0.75 µg，乘以2为重复实验所需量，并再乘以1.3的死体积因子）。

7. 按照所需孔数（每孔2 × 10⁵个COS7细胞乘以孔数，再乘以1.3死体积因子）离心细胞，条件为200 g、5分钟、37°C，然后重悬于相应体积的预热（37°C）电穿孔缓冲液中（20 µl × 孔数 × 1.3）。
注意： 每块板所需孔数计算公式为：[(n × 8) × 2] + 9，其中n为待检测的蛋白对数量，8为每对蛋白的标签组合数，2为重复实验，额外9孔为对照实验孔。

8. 将52 µl细胞悬液（20 µl × 2重复 × 1.3死体积因子）加入到预制DNA中，并通过吹吸混匀。

9. 每个样本向96孔核转染板中分两孔加入20 µl DNA-细胞混合液。

10. 使用核转染系统进行电穿孔转染，COS7细胞（DSMZ ACC 60）适用程序为FP-100。
注意： 不同类型细胞和电穿孔系统需分别优化转染程序。

11. 转染后，每孔加入预热的无酚红RPMI 1640培养基（80 µl），并彻底混匀。

12. 准备一个透明底白色96孔板，每孔预加150 µl预热的无酚红RPMI培养基。

13. 从步骤11的板中，每孔取50 µl转移至步骤12中准备的白色板中。
注意： 若荧光素酶信号较弱（如蛋白表达量低），建议使用白色96孔板以获得高发光信号。但白壁透明底板的优势在于可进行显微镜下细胞观察，判断细胞密度与活力，也适用于荧光成像分析YFP标签蛋白的亚细胞定位。

14. 在37°C、5% CO₂条件下培养细胞。
注意： 若Rluc信号较弱，可延长转染后培养时间（最多至48小时），或采用不同温度条件（如30°C）以提高蛋白表达水平。

BRET信号的检测

1. BRET信号可在转染后24小时进行检测。​注意： 如果Rluc信号较弱，请参阅“转染”部分第12步的说明。

2. 为了进行BRET测量，需准备实验板： 吸取培养基（170 µl），然后将板放入发光检测仪中。
注意： 对于在悬浮细胞中进行的BRET实验，准备BRET检测板时需特别注意避免细胞的意外丢失。关键步骤是在加入荧光素酶底物之前吸取培养基。可行的方法之一是先离心板子，然后小心地去除培养基。或者，也可以将细胞培养在每孔150 µl的培养基中，然后直接向每孔加入较高浓度的coelenterazine。为了使培养基和coelenterazine获得充分稀释，应在注入coelenterazine时让板在检测仪中震荡混匀。

3. Coelenterazine溶液需在检测前至少15分钟准备：
若用于一块96孔板的BRET检测，可将127 µl用甲醇悬浮的coelenterazine原液加入1 ml Renilla荧光素酶检测缓冲液中，配制成300 µM浓度的溶液。在开始检测前，将1.1 ml 该300 µM溶液用6.6 ml PBS稀释（相当于一块板的总体积：70 µl/孔 × 96孔 + 1 ml 死体积，用于注射泵预冲）。

4. 在注射泵使用之前，用纯水冲洗泵体，然后用coelenterazine溶液进行预注。

5. 进行BRET检测时，需要设置以下流程：
先依次向每孔注射70 µl的coelenterazine溶液（最终浓度为30 µM），静置孵育2分钟。随后，使用双波长发射检测功能，在485 nm（Rluc信号）和535 nm（BRET信号）处采集信号，持续60秒，分为60个时间间隔。
注意： 根据需检测的孔数，为减少整体检测时间并减轻细胞应激，可能需要设置交错的注射、孵育和检测流程，或将检测时间缩短至最少10秒。

数据计算

本节介绍如何计算BRET比值，以便根据发光强度对蛋白质构象进行近似定量分析。

1. 为保证数据的可靠性，转染细胞在485 nm处的Rluc信号应超过未转染背景对照的平均值加上其9倍标准误差。

2. BRET比值的计算公式如下：

说明：

• R–是BRET比值
• ​????ᴀ –受体荧光素发射在535 nm处的发光强度
• ????ᴅ -供体荧光素发射在485 nm处的发光强度
• cf：校正因子，定义为：()

其中“control”（对照）指的是仅共转染供体融合蛋白与YFP、而不包含目标蛋白的构建体。

3. 作为阳性对照，YFP-Rluc融合蛋白应产生约1.0的BRET比值。

4. 如果在八种标签组合中至少有一种产生的BRET比值超过方法特异性阈值0.1，则认为两个目标蛋白之间存在正向相互作用。

注意：
该方法特异性的0.1阈值是在实验室中通过监督方式确定的。使用本文或类似设置下的参数默认该阈值可直接适用。然而，在大规模数据集的分析中，我们建议重新基于一个参考数据集来确定该阈值。该参考数据集应包含一组已知具有相互作用的人类蛋白对，以及一组随机选择的蛋白对。

参考文献

1. Gersting, S. W., Lotz-Havla, A. S., & Muntau, A. C. (2012). Bioluminescence Resonance Energy Transfer: An Emerging Tool for the Detection of Protein–Protein Interaction in Living Cells. Functional Genomics, 253-263. Springer.

2. Xu, Y., Piston, D. W., & Johnson, C. H. (1999). A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: Application to interacting circadian clock proteins. PNAS, 96(1), 151–156. doi:10.1073/pnas.96.1.151

阿拉丁官网：https://www.aladdin-e.com