C2柱的规格

应用：荧光团和紫外发色团标记的聚糖的荷电分析和HPLC纯化。

描述：C2 HPLC柱包含具有大孔聚合物阴离子交换涂层的颗粒，该涂层针对复杂聚糖混合物的阴离子交换色谱进行了优化。

颗粒：8μm聚苯乙烯二乙烯基苯，带有稳定的季铵化聚乙烯亚胺涂层

色谱柱尺寸                  型号 #                                             尺寸                                            柱体积
                                   C498853-01                               4.6 x 150毫米                                  2.49 ml
                                   C498853-02                               4.6 x 50 毫米                                   0.83 ml

柱管：不锈钢

流速：典型流速=0.3-2.0 ml/min      最大流速=4 ml/min

压力：压力不得超过300psi（207bar）

pH范围：1-13

温度：典型工作温度=30℃。但是提高温度可以改善一些样本的分辨率。

最大温度范围=10-60℃

溶剂：聚糖分析的典型溶剂系统包括含有乙腈和甲酸铵（N-BUFFX40）乙酸铵或乙酸钠盐的含水缓冲液梯度。

避免使用强氧化剂和阴离子洗涤剂。

柱保护：将所有溶剂过滤至0.2μm，并使用氦气喷射或真空脱气进行脱气。

在加载到柱上之前，使用0.2μm滤膜过滤所有样品。

在样本注射器和柱之间安装一个直列式过滤器。

请致电我们，咨询最适合使用的样品和在线过滤器。

样品量：可装载在柱上的聚糖样品的最大量取决于聚糖组分的数量和类型以及任何非聚糖材料的性质。成功分析的典型范围是每个样品峰1 nmol-1 nmol，总聚糖高达200 nmol。

合适的样品：合适的样品包括标有以下标签的聚糖：

2-AA（2-氨基苯甲酸）、2-AB（2-氨基苄酰胺交换）

样品：将样品过滤至0.2μm，然后使用离心蒸发器干燥。

制备：重新溶解在5-50μl的起始缓冲液（即HPLC梯度开始时使用的溶剂混合物）中，然后注入。

样品检测：荧光或紫外吸收取决于所用染料

处理：确保使用的玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。在所有样品处理程序中使用无粉末手套，避免污染环境碳水化合物。

安全：请阅读所有使用化学品的材料安全数据表（MSDS）。

所有涉及标记试剂的过程都应使用适当的个人安全防护措施-眼镜、耐化学手套（如丁腈橡胶）等-并在适当的情况下在实验室通风柜中进行。

仅供研究使用。不用于人类或药物

HPLC系统要求
C2柱可以与能够以0.3至2.0ml/min的流速递送准确梯度的任何HPLC泵送系统一起使用。通常，在高压下（在泵头之后）混合洗脱液的系统具有较低的死体积，并提供更准确的梯度，该梯度适合于柱所需的流速。应使用低死体积注射器。要使用的回路大小取决于分离模式和样本量。对于分析运行，最好尽量减少样品体积，通常使用10μl回路，样品注入体积为1至5μl（部分填充）或>10μl（完全填充）。对于电荷模式分离，通常，由柱保留（因此有效地集中在柱上）的阴离子聚糖能够合理地耐受较大的注射体积，而非阴离子聚糖不被柱基质保留，并且将以与注射体积成比例的体积洗脱。

2-AB或2-AA标记的寡糖需要荧光检测器（λex=330 nm，λem=420 nm）。这可以是过滤器或单色器类型。用于OPA肽分析的荧光过滤器工作良好，通常，从含有2-5 pmol 2-AB或2-AA标记聚糖的C2柱洗脱的这些聚糖峰可以以良好的信噪比检测到。还可以使用UV（254nm）检测2-AB和2-AA标记的聚糖，与荧光相比。未标记的寡糖，特别是含有N-酰基氨基的寡糖，可以在190-210 nm处检测到。降至1 nmol水平。然而，当使用UV检测时，特别是在短波长下，缓冲液和溶剂的吸收成为问题。

立柱的安装

在立柱安装过程中，我们建议：

• 您应该使用标准的1/16“OD管和不锈钢或PEEK（聚醚醚酮）Valco兼容配件将C2柱连接到HPLC系统。建议使用手拧紧PEEK接头和卡套管（0.17 mm/0.007“ID），以便于连接并尽量减少对柱螺纹的损坏。流向由列标签上的箭头指示。

• 保持注射器到柱和柱到检测器之间的管道长度尽可能短，以尽量减少分散效应。

• 在喷射器之前或喷射器和C2柱头部之间安装一个具有最小死体积的直列式过滤器，以防止颗粒对柱造成损坏。

• 在分析任何样品之前，应使用以下协议对新安装的柱进行调节。

新安装立柱的预处理

使用色谱柱前，建议采取以下预处理步骤：

按顺序用以下洗脱剂以1.0ml/min的流速依次冲洗色谱柱：

• 缓冲液A的低离子强度组分，例如0.01M Tris-HCl，pH 8.0，持续5分钟

• 缓冲液B的高离子强度组分，例如0.01 M Tris-HCl、0.5 M NaCI、pH 8.0。继续使用此洗脱液，直到达到所需灵敏度的稳定基线。

• 用缓冲液A平衡5分钟。

• 与起始缓冲区平衡。

柱清洁和储存

大量使用后，C2柱可能被强吸附的样品成分污染，从而导致柱性能下降。

• 如果污染较轻，请按照上述“色谱柱预处理”部分中的方案清洁色谱柱。然后，在适当的起始缓冲液中平衡，在不注入样品的情况下运行电荷模式梯度以检查基线。

• 如果需要更严格的清洗，用0.1M的酸（如乙酸或盐酸）和0.1M的碱（如氢氧化钠）清洗。

• 如果污染是由于小的疏水分子（如脂肪、洗涤剂和肽）造成的，则应使用有机醇（如异丙醇）清洗基质。

• 添加0.1%三氟乙酸可能是有利的在不注入任何样品的情况下，使色谱柱经历两个完整的C2充电模式循环。

• 柱清洗在低流速（例如0.2ml/min）下最有效。

• 对于长期储存，应使用1M的氯化物溶液清洗色谱柱。

• 用水冲洗后，可引入含有0.2%叠氮化钠的约0.1M Na2SO4的存储缓冲液。保持室温。

样品制备

用于C2柱电荷模式分析的样品必须不含盐或阴离子洗涤剂，且不含任何颗粒。

阴离子聚糖不能用简单的混合床离子交换树脂脱盐，因为它们本身会被树脂保留。挥发性盐可以通过在离心蒸发器中使用高真空重复干燥，然后在水中溶解（通常为50-100μl），直到没有可见的盐残留物来去除。

或者，可以使用EB10滤筒实现脱盐。如果使用EB10滤筒，则确保通过上述重复干燥和溶解从样品中去除所有三氟乙酸（用作滤筒洗脱的微量添加剂）。这是为了确保任何唾液酸化聚糖在注射到柱上之前完全脱质子化。

如果暴露于酸性条件和升高的温度，唾液酸化聚糖可能会脱分析。通过（a）尽量减少暴露于酸（如果可能，保持pH值高于5），以及（b）尽量避免暴露于高于25℃的温度，避免对此类样品进行脱分析。

使用具有0.2μm孔径膜的微离心过滤器可以从样品中去除颗粒。

阴离子和中性甘氨酸的电荷模式分析

通过使用2-AB甘氨酸标记试剂盒，用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）或用2-AA甘氨酸标记试剂盒，用2-氨基苯甲酸基（2-AA）进行荧光标记，然后使用C2 HPLC分析微微摩尔量的寡糖。

程序概要如下：

• 寡糖用2-AB或2-AA还原胺化标记。

• 然后使用S滤芯去除多余的标记试剂。

• 标记的寡糖通过阴离子交换HPLC在C2柱上进行分析，并进行荧光检测。

以下是C2柱使用条件指南。始终使用HPLC级缓冲盐和溶剂以及纯水。建议使用合适的酸和碱（如甲酸和氢氧化铵）制备缓冲液，因为它们通常比相应的盐更纯。缓冲液浓度始终以阴离子表示。始终用氢氧化铵滴定精确测量量的乙酸或甲酸（aq）至所需的pH值。仅将单独测量体积的乙腈与水或水缓冲液混合-不要用有机溶剂“加满”水溶液（反之亦然）。最后，在使用前对缓冲液进行彻底脱气非常重要。这可以通过超声处理、氦气喷射或真空脱气来实现。

立柱：C2-4.6 x 150 mm

溶剂：溶剂A=水溶剂B=200mM乙酸钠

流速：1ml/min。

梯度：

注：具有三个或更多负电荷的聚糖可能需要更高百分比的溶剂B。

荧光检测：

                       λex=330 nm，λem=420 nm

图1：2AB标记的聚糖标准物的分离（皮摩尔浓度）C2 4.6 x 150 mm。

图2：2AB IgG聚糖的分离  C2-4.6 x 150毫米

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