简介 
          用于检测存活细胞的四唑化合物分为两个基本类别： 
          1.带正电荷的化合物（MTT），可轻易穿透有活力的细胞：

          新陈代谢活跃的存活细胞能够将 MTT 转化为紫色的甲臢产物。因此，颜色的形成可以作为有活力细胞的有用标记。不过，这种方法的培养时间较长（通常为 4 小时）。此外，甲状腺素产物不溶于水，因此在记录吸光度读数之前必须添加增溶试剂。

          2.不能穿透细胞的带负电荷的化合物（MTS、XTT、WST-8）： 
          带负电荷的化合物必须与中间电子偶联试剂结合，后者可以进入细胞，被还原，然后排出细胞，将四氮唑转化为可溶性的甲臢产物。这种方法的培养时间为 1-4 小时。由于生成的甲臢是可溶的，因此无需添加增溶试剂，从而更加方便。

实验规程 
MTT 检测协议

          MTT 检测法用于测量细胞代谢活性，作为细胞活力、增殖和细胞毒性的指标。这种比色法是基于代谢活跃的细胞将黄色四唑盐（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑或 MTT）还原成紫色的甲臢晶体（图 1）。有活力的细胞含有依赖 NAD(P)H 的氧化还原酶，可将 MTT 还原为甲臢。使用溶解液溶解不溶性的甲臢晶体，然后使用多孔分光光度计在 500- 600 纳米波长处测量吸光度，对得到的彩色溶液进行定量。溶液颜色越深，表示有活力、代谢活跃的细胞数量越多。

MTT 试剂制备
配制 MTT 溶液

          1. 将 MTT 溶解在 pH=7.4 的杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中，浓度为 5 mg/ml。

          2. 将 MTT 溶液用 0.2 µM 过滤器过滤消毒，装入无菌避光容器中。

          3. 将 MTT 溶液避光保存，经常使用时保存在 4°C 下，长期保存时保存在 -20°C 下。

制备 MTT 溶剂

          4 mM HCl，异丙醇中 0.1% NP40
增溶剂

          1. 选择适当的耐溶剂容器，并在通风橱内工作。

          2. 在 2%（体积分数）的冰醋酸中制备 40%（体积分数）的二甲基甲酰胺（DMF）。

          3. 加入 16%（重量/体积）十二烷基硫酸钠（SDS）并溶解。
          4. 调节至 pH = 4.7 室温保存，以避免 SDS 沉淀。如果出现沉淀，则升温至 37°C，然后混合以溶解 SDS。

MTT 检测协议

          1. 丢弃细胞培养物中的培养基。对于粘附细胞，小心吸出培养基。对于悬浮细胞，在与微孔板兼容的离心机中以 1,000 xg、4°C 旋转 96 孔板 5 分钟，然后小心吸出培养基。另一种方法是在培养基中加入等体积的 MTT 溶液。确保每个样品都有相同体积的现有培养基。
          2. 在每个孔中加入 50 µL 无血清培养基和 50 µL MTT 溶液。
          3. 37°C 孵育 3 小时。
          4. 培养结束后，在每个孔中加入 150 µL MTT 溶液。
          5. 用铝箔包裹平板，在轨道摇床上摇晃 15 分钟。有时可能需要移液才能完全溶解 MTT 甲氮。
          6. 在 OD=590 纳米处读取吸光度。在 1 小时内读取平板吸光度。

WST-8 协议

          WST-8 是第二代四氮唑盐，可用作细胞活力的显色指示剂。有活力的细胞还原略带黄色的 WST-8 时会产生橙色的甲臢产物，这与有活力细胞的数量成正比，对于包括非粘附细胞在内的许多细胞系来说，其范围为 200-25,000 个细胞/孔。此外，WST-8 在细胞还原时会产生水溶性的畸形淀粉，不需要额外的步骤来溶解畸形淀粉，这为该方法提供了额外的优势。

试剂配制
          WST-8 试剂溶液配制成水溶液，其中含有 5 mM WST-8、0.2 mM 1-methoxy PMS 和 150 mM NaCl。

实验步骤
          - 将细胞悬浮液接种到 96 孔板（100 微升/孔）上，加入或不加入测试化合物，在 37°C 的湿度为 5% CO2 的恒温培养箱中培养至所需的暴露时间。
          - 每孔加入 10 µL WST-8 试剂溶液，37°C 孵育 2 小时。培养结束后，使用多板阅读器在 450 纳米波长处测量吸光度。

MTS 协议

          MTS 检测法旨在评估细胞的代谢活性和活力。该检测法是指四唑胺盐 MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium）在酚嗪甲硫酸盐的作用下转化为紫色的甲臢。这种酶是依赖于 NADPH 的脱氢酶，在有活力的细胞中十分活跃。由此产生的甲酰肼溶液的吸光度与细胞数量成正比，可使用分光光度计进行量化。吸光度的测量波长为 490-500 纳米。除细胞活力外，MTS 检测法还可用于测量细胞增殖和评估细胞毒性。

试剂制备
MTS 溶液（含 PES）

          1. 将 MTS 粉末溶于 DPBS 至 2 mg/ml，形成金黄色的透明溶液。
          2. 将 PES 粉末溶于 MTS 溶液至 0.21 mg/ml。
          3. 用 1N HCl 调节 pH 值至 6.0 至 6.5。
          4. 用 0.2 μm 过滤器过滤消毒，装入无菌避光容器中。
          5. 将含有 PES 的 MTS 溶液避光保存，经常使用时保存在 4°C 下，长期保存时保存在 -20°C 下。长期保存。

MTS 检测协议

          1. 在 96 孔板中制备细胞和测试化合物，最终体积为 100 微升/孔。可选择孔，用于背景减去。
          2. 培养所需的暴露时间。
          3. 在每个孔中加入 20 µl 含有 PES 的 MTS 溶液（MTS 的最终浓度为 0.33 mg/ml）。
          4. 37°C 孵育 1-4 小时。
          5. 在 490 纳米波长处记录吸光度。

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