在蛋白质相关实验中，准确掌握样品蛋白浓度，是酶学反应、定量Western、质谱上样、免疫检测等后续工作的基础前提。不同检测方法在原理、灵敏度、抗干扰能力和仪器依赖程度上存在明显差异，因此有必要系统梳理常见的11种蛋白定量方法，为不同样本类型和实验目的提供更有针对性的选择参考。

一、电泳法

【原理】

在电场作用下，带电的样品组分在惰性支持介质中按各自电泳迁移率向相应电极方向泳动，不同组分因迁移速度不同而分离成狭窄条带。通过适宜的显色或检测方式记录电泳图谱，并结合标准品或内标，可用于定性、半定量或定量分析蛋白质含量。

【优点】

操作相对简便、速度较快、样本用量少，并且适合自动化分析；同时可以在一次实验中兼顾“分离+定量+纯度评估”。在常规SDS-PAGE或原位电泳体系中，常用的组分包括Tris缓冲液、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺及N，N′-亚甲基双丙烯酰胺等，这些试剂的配比和纯度会直接影响条带分离度、定量线性范围以及蛋白回收率，因此在建立电泳定量方法时需要同步优化缓冲体系和凝胶配方。

【缺点】

易受核酸、多糖等共存分子干扰；定量精度依赖条带解析度、染色线性和图像分析方法，整体操作和数据处理相对间接。

【具体应用】

广泛用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性和半定量分析，也可用于测定相对分子质量、等电点及进行少量制备等。

二、比浊法

【原理】

在免疫化学反应中，样本中的目标蛋白与特异性抗体结合形成免疫复合物，这些颗粒会对入射光产生散射。散射光强度在一定范围内与待测蛋白的浓度成正比，将样本散射信号与已知浓度标准相比即可推算蛋白含量。

【优点】

灵敏度和特异性较高，线性范围较宽，可对特定蛋白进行定量分析，适合临床和检验场景下的自动化检测。

【缺点】

通常需要专用的光学检测设备或特种蛋白分析仪，对仪器和试剂配套依赖较强。

【具体应用】

主要用于免疫化学检测，如血清中特定蛋白（免疫球蛋白、补体、急性期蛋白等）的测定。

三、BCA法

【原理】

BCA法是Lowry法的改进型双缩脲方法。在碱性条件下，蛋白质中的肽键可将Cu2+还原为Cu+，随后Cu+与BCA（bicinchoninic acid）形成紫蓝色络合物，在562 nm处具有吸收峰。Cu+的生成量与蛋白质量成正比，因此可根据样品在562 nm的吸光度，结合标准曲线计算蛋白浓度。在实际操作中，常用BCA显色体系由BCA钠盐、硫酸铜工作液和适宜的碱性缓冲液组成，并配合牛血清白蛋白（BSA）标准品制备标准曲线，可在微量样本条件下实现总蛋白的批量定量分析。

【优点】

试剂体系相对简单，终产物颜色稳定，显色波长较高、背景干扰较小，适合多样本批量测定。

【缺点】

反应时间相对较长；在加热或长时间反应过程中部分蛋白质可能发生不可逆变性；某些还原剂、螯合剂等试剂可能干扰显色反应。

【具体应用】

常用于生物化学和分子生物学研究中的总蛋白浓度测定，适合细胞裂解液、组织匀浆、部分纯化蛋白等样品。

四、Lowry法

【原理】

在碱性条件下，蛋白质中的巯基、酚羟基等基团可将Cu+还原为Cu+，随后Cu+与Folin–酚试剂反应生成蓝色络合物。蓝色产物在特定波长（常用340 nm或750 nm附近）有吸收峰，其吸光度与蛋白含量成正比。常用的Lowry试剂体系包含硫酸铜、酒石酸、碳酸钠以及Folin–Ciocalteu酚试剂，可配合酪氨酸或牛血清白蛋白（BSA）等标准蛋白制备标准曲线，以获得较高灵敏度的总蛋白定量结果。

【优点】

灵敏度较高，对水溶性蛋白质的定量非常有效，是经典且应用广泛的总蛋白测定方法之一。

【缺点】

操作步骤相对繁琐，需严格控制加样和显色时间；Folin–酚试剂配制和保存条件要求较高，易受光和温度影响；对某些缓冲体系或添加剂较敏感。

【具体应用】

广泛用于不同来源、不同环境下的蛋白质混合物或粗提物的含量测定，尤其是在传统生化研究中应用较多。

五、邻位连接技术（Proximity Ligation/PLA类）

【原理】

通过将特异性蛋白识别分子（如抗体、适配体等）分别与两条带有不同DNA序列的单链DNA连接，形成PLA探针。在类似ELISA的孵育步骤中，两条探针可同时结合到同一个待测蛋白分子上，使其所携带的DNA尾部在空间上邻近。随后在过量互补连接序列和DNA连接酶作用下，两条DNA尾部的5'端和3'端与互补序列杂交并发生连接，形成一个环状的“蛋白–识别分子–单链DNA”复合物，可通过后续扩增或信号放大进行高灵敏检测。

【优点】

检测灵敏度极高，特异性好；能够在低样本量条件下检测低丰度蛋白或蛋白–蛋白相互作用，样品损耗小，适合复杂背景样本。

【缺点】

实验流程相对复杂，对探针设计、连接反应和后续信号扩增步骤要求较高，整体方法学建立成本较高。

【具体应用】

可用于目标蛋白的超灵敏检测、蛋白–蛋白相互作用分析、细胞或组织中的空间蛋白分布研究等。

六、蛋白芯片技术

【原理】

将大量不同的蛋白质有序固定在固相载体（如玻片、膜或芯片基底）上形成蛋白芯片。再用带有荧光或其他可检测标记的探针分子（如抗体、受体、底物等）与芯片上的蛋白质发生特异性结合，通过检测芯片表面的信号强度来判断相应蛋白的存在与相对丰度。

【优点】

实现高通量、微量化检测，可在一次实验中同时检测大量蛋白质或相互作用；数据密度高，适合系统生物学研究和大规模筛选。

【缺点】

芯片制备、蛋白固定和定量标准化难度大；整体成本较高，对平台和技术条件要求高，方法学建立和结果互通性存在挑战。

【具体应用】

用于分析蛋白质之间的相互作用、蛋白翻译后修饰（如磷酸化）、蛋白–DNA相互作用以及疾病相关标志物筛选等。

七、胶体金测定法

【原理】

胶体金是氯金酸形成的金纳米颗粒水溶胶，呈红色，具有较高电子密度并可与多种蛋白质结合。胶体金颗粒带负电且表面疏水，与蛋白结合后粒径和光学性质发生变化，颜色由红向蓝或紫偏移，颜色变化程度与蛋白质量在一定范围内相关，可用于蛋白质定量或半定量检测。

【优点】

操作简单、快速，对环境条件要求低，适合现场或快速筛查；也常用于构建便携式免疫胶体金试纸条。

【缺点】

检测灵敏度相对较低，难以对极低浓度蛋白进行精确定量；结果易受颗粒聚集状态影响。

【具体应用】

常用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域中作为标记或示踪，也可用于构建快速检测条，对某些蛋白或抗原进行定性和半定量测定。

八、Bradford法

【原理】

在酸性条件下，染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，游离染料主要为红色阳离子或绿色中性形式，而与蛋白结合后的阴离子蓝色形式在595 nm左右具有吸收峰。蓝色复合物的吸光度与蛋白浓度在一定范围内呈正比，可通过测定样本的吸光度计算蛋白含量。Bradford显色工作液通常由考马斯亮蓝G-250配合磷酸或柠檬酸缓冲体系配制，并以牛血清白蛋白（BSA）等蛋白标准品建立标准曲线，不同蛋白与染料的结合能力存在差异，因此在方法比较或实验记录中应注明所用标准品和缓冲条件。

【优点】

操作快速、步骤简单，显色过程在几分钟内完成；耗材成本低，不需要昂贵设备，适合日常大量样品检测。

【缺点】

染料对不同蛋白的结合能力不一致，方法对蛋白质构象和氨基酸组成有一定依赖；难以区分蛋白质及其修饰状态，某些缓冲组分（如高浓度去污剂）会干扰显色。

【具体应用】

常用于溶液中总蛋白浓度测定，是实验室日常蛋白定量中非常常见的一种快速方法。

九、紫外光谱法（A280法）

【原理】

大多数蛋白质含有芳香族氨基酸残基（如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等），这些残基在约280 nm的紫外光区域具有特征吸收。蛋白质溶液在280 nm处的吸光度与其浓度在一定范围内成正比，可利用比耳–朗伯定律进行定量计算。在利用A280法进行定量时，常以BSA等已知摩尔消光系数的标准蛋白建立标准曲线，或根据目标蛋白中色氨酸、酪氨酸残基含量计算理论消光系数，以提高浓度计算的准确性。

【优点】

操作极为简便、快速，不需额外试剂，几乎不消耗样品，测定后样品可回收使用；适合对高纯度蛋白进行在线或实时监测。

【缺点】

专一性较差，对含有芳香族基团或其他吸收物质（如核酸）的共存杂质较敏感；对蛋白纯度、溶剂背景要求高，准确度受干扰因素影响较大。

【具体应用】

用于高纯度蛋白质的定量、蛋白纯化过程中在线监测，以及对样品进行初步定量、定性和结构信息推断。

十、凯氏定氮法

【原理】

样品在浓硫酸存在下加热消化，蛋白质中的有机氮转化为铵盐。随后在强碱性条件下将氨蒸出，用硼酸溶液吸收，形成铵盐，再用标准酸溶液滴定。根据标准酸的消耗量可计算样品中总氮含量，进而按换算系数求得蛋白质含量。常规凯氏定氮消化液多由浓硫酸配合硫酸钾、硫酸铜等催化剂组成，以提高消化温度和加快有机物分解；蒸馏后的氨通常用硼酸溶液吸收，再用标准酸溶液回滴，从而实现对总氮含量的准确测定。

【优点】

适用范围广，对多种类型样品（食品、饲料、生物样品等）均适用；测定结果准确、重现性好，是许多标准方法中的经典参照法。

【缺点】

操作步骤较复杂、耗时长，需要高温消化和蒸馏设备；试剂消耗量大，使用浓硫酸和强碱，对安全和环保要求较高。

【具体应用】

广泛用于食品、农产品、饲料以及部分生物样品中总氮和总蛋白含量的测定，是质量控制和标准检测中常用的参考方法。

十一、免疫测定法

【原理】

基于抗体与抗原（蛋白质）之间的高亲和性和特异性，通过构建不同形式的免疫反应体系来检测特定蛋白质含量。常见形式包括：用于检测抗体的间接ELISA，用于检测抗原的双抗体夹心法，以及用于小分子抗原或半抗原的竞争法等。最终通过酶标、荧光、化学发光等信号输出实现定性或定量分析。以酶联免疫检测为例，常用的体系包括包被抗体、封闭用牛血清白蛋白或脱脂奶粉、含Tween 20的洗涤缓冲液以及过氧化物酶底物TMB等，标准品和质控品的浓度梯度设计直接影响标准曲线形状和定量下限。

【优点】

操作相对简单，特异性好，可对特定蛋白进行选择性检测；适合临床诊断和生物制药分析中对特定标志物的定量。

【缺点】

定量精确度依赖于抗体质量和标准曲线，批次间差异和抗体亲和力变化可能影响结果；建立方法时需要标准品和较完善的质控体系。

【具体应用】

广泛用于生物制药分析、临床诊断（如血清标志物检测）、食品安全检测以及环境样品中蛋白性污染物或毒素的监测等。

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