蛋白质在储存中面临的主要风险包括：表面吸附与聚集、构象变性、化学降解（氧化/水解/脱酰胺等）、微生物污染。合理选择缓冲体系与保护剂，并制定合适的温度与分装策略，能显著延长稳定期、保持活性。

一、防止表面吸附和聚集

蛋白质在低浓度条件下易发生容器壁（如EP管、玻璃器皿）吸附而导致回收率下降；在高浓度条件下分子间作用增强，倾向于聚集并沉淀。

1.惰性蛋白

牛血清白蛋白

低浓度蛋白（通常<1 mg/mL）易吸附容器壁时，可先让BSA吸附以保护目标蛋白。常用0.01%–0.1%（w/v），也有用到0.5%的。可能干扰质谱、免疫学检测（交叉反应/背景）及Bradford法定量；BSA能结合疏水配体和金属离子，可能影响某些功能测定。

酪蛋白

常用于免疫学体系中封闭非特异结合。同样可能干扰下游免疫检测定量。

2.非离子表面活性剂

Tween-20、Triton X-100

覆盖疏水界面，降低空气-液面/容器壁的构象扰动与聚集风险，尤其对膜蛋白或疏水性蛋白有效。一般0.005%–0.1%（v/v）；常见起点0.01%。可能改变酶活或影响某些结合/分离步骤；Triton比Tween去污更强，选择需做小量预实验。

Poloxamers（如Pluronic F-68）

在剪切/搅拌/冻融应力下对某些蛋白更温和，可作为备选。

二、维持结构稳定（抗变性）

这些试剂通过稳定蛋白质的天然构象，防止其伸展变性。

1.多元醇和糖类

甘油（Glycerol）

优先排阻/调水效应，稳定折叠；降低冰点，减少冰晶损伤。典型10%–50%（v/v）。50%甘油在−20°C下不完全冻结，适合“不完全冻存”以避免反复冻融。升高黏度、可能轻度影响酶学速率与光谱测量；高浓度下移液不便。

蔗糖、海藻糖

优先排阻/玻璃化，在冻干与−80°C冻存中常用。一般2%–10%（w/v）；冻干可更高。优选非还原糖（蔗糖、海藻糖）；避免使用葡萄糖等还原糖做长期湿态储存，防止糖基化。

2.氨基酸和胺类

甘氨酸、脯氨酸、精氨酸盐酸盐、牛磺酸

改善可溶性、抑制聚集或折叠中间体的错误互作；精氨酸常用于复性/高浓度制剂中缓聚。常见50–500 mM，依蛋白筛选。精氨酸高浓度有时会降低某些蛋白稳定性或影响活性——需蛋白特异性优化。

三、防止化学降解

蛋白质可能发生氧化、水解或脱酰胺等化学修饰。

1.还原剂（防止二硫键错误形成和氧化）

DTT（二硫苏糖醇）

强而常用，但在氧存在下、尤其pH>7时易自氧化，半衰期较短。临用前新配或定期补加；常见0.1–5 mM。

β-巯基乙醇（β-ME）

气味强烈、挥发，效力相对DTT弱，现多被替代。

TCEP（三(2-羧乙基)膦）

更耐氧、更稳定，pH兼容范围广；对许多体系是更好的长效选择。会持续还原二硫键；若蛋白结构/功能依赖二硫键，长期与TCEP共存可能破坏天然结构。此外，TCEP可干扰巯基-马来酰亚胺类偶联反应；与某些金属/亲核试剂体系存在相容性问题——使用前确认下游需求。

2.金属螯合剂（防止金属离子催化的氧化）

EDTA（0.1–2 mM常见）

螯合痕量Fe/Cu等，降低Fenton类反应。金属蛋白/金属辅因子依赖酶（如锌蛋白、Mg²⁺依赖复合体）不宜加入；对His-tag蛋白后续Ni-NTA纯化也会有影响。

3.蛋白酶抑制剂

广谱Cocktail（如含AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin、E-64、Bestatin等）

样品含潜在蛋白酶污染时使用，尤其细胞/组织裂解物。部分抑制剂不可逆/会干扰下游酶学；有EDTA的配方会影响金属酶/亲和层析。对重组纯化蛋白且来源清洁时，通常无需长期共存。

4.抗菌剂

叠氮化钠（NaN₃，0.02%–0.05% w/v）

常用于4°C短期储存抑菌。剧毒；禁止用于细胞/体内相关实验；会抑制HRP等含血红素酶；与金属管路可形成金属叠氮化物（爆炸风险），处置需规范。

硫柳汞

部分抗体溶液中仍有历史使用，但汞化合物的安全与合规风险高，多数场景已被更安全方案替代。

四、缓冲系统（维持pH）

1.常用缓冲液：Tris-HCl、PBS（磷酸盐缓冲盐水）、HEPES、MOPS等。

2.选择原则：pKa应在目标pH的±1以内；考虑温度敏感性与盐/金属离子相容性。

• ​Tris：pH随温度显著变化（约−0.028 pH/°C）；低温/冷冻会造成实际pH偏离。
• ​PBS：与高浓度二价阳离子（Ca²⁺/Mg²⁺）或某些沉淀风险体系不相容；与Ni-NTA等金属亲和体系有潜在影响。
• ​HEPES：温度稳定性优于Tris，常用于4°C或室温操作。

五、推荐基础配方

20-50 mM Tris-HCl, pH 8.0（缓冲系统）

150 mM NaCl（提供一定的离子强度，模拟生理条件）

10% (v/v)甘油（稳定结构和防冻）

1 mM EDTA（防止金属催化氧化）

0.5 mM TCEP（防止氧化，比DTT更稳定）

0.02% NaN₃（抗菌，如需要）

六、储存策略

①高浓度储存：适度提高蛋白质浓度通常有利于稳定性；可先浓缩后分装。

②分装管理：无论何种温度条件，均应小体积分装，避免反复冻融。

③储存温度选择：

• 4℃：仅用于短期（数天–数周）；建议加入防腐/抑菌剂。
• –20℃：常用方案；需加入甘油20%–50%（v/v）以减轻冻融与冰晶损伤。
• –80℃：长期保存优选；可不加甘油，但必须分装。
• 液氮/气相液氮：用于极珍贵样品，可实现近似“玻璃化”保存。
• 冻干：最长稳方式；配合蔗糖、海藻糖等保护剂。

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