Q1：与蛋白质分子质量标准相比，蛋白质没有迁移到期望的位置？

• 由于不同蛋白的氨基酸组成与序列不同，结合SDS的能力也不同；因此即便理论分子量相同，跑胶时的表观分子量也常与理论值不一致，甚至偏差较大。
• 除了降解外，天然剪切或翻译错误也会产生截短蛋白。建议重新核查该蛋白的DNA序列：是否存在稀有密码子、内部起始或终止密码子，或其他可能导致翻译不完全的突变。

Q2：蛋白质条带染色不佳，呈弥散状，或者染色开始后条带消失？

1. 未及时固定，蛋白从胶中扩散→跑完立刻固定（如40% MeOH/10% AcOH，20–30 min），再染色；避免先泡纯水。
2. 样品盐/去垢剂过高（SDS、Triton、尿素等）→稀释/透析或TCA/丙酮沉淀后重溶；降低上样盐度。
3. 上样过量或胶浓度不匹配→降低上样量；为小蛋白用高%T/梯度胶，为大蛋白用低%T；跑胶电压别过高，控温避免“笑脸”。
4. 样品粘稠（核酸/黏多糖）致拖尾→加Benzonase/DNase处理或机械剪切，降低黏度。
5. 变性/还原不充分或过度→按标准加热（如95°C 5 min）与足量DTT/β-ME；必要时烷基化减少聚集。
6. 染/脱色条件不当或试剂失效→选用新鲜染液；Coomassie先固定再染，脱色勿过度；银染严格按时序，避免强脱色把条带“洗没”。
7. 蛋白降解→全程低温、加蛋白酶抑制剂；缩短制样与电泳时间。
8. （在膜上）Ponceau S本就可逆→Ponceau脱洗后条带变淡属正常；若需可见标尺/总蛋白，请重新短染或改用更稳定的总蛋白染料。

Q3：蛋白质条带分辨率不够？

• 可从丙烯酰胺总浓度（%T）、交联剂比例（%C，双丙烯酰胺）与电泳时间三方面优化。一般来说，提高%T与%C（孔径更小、交联更充分）有利于小分子蛋白分辨；降低%T或%C更利于大分子蛋白进入并分开。增加交联剂会缩小胶孔径，同时需相应调整原有的%T参考范围。适当延长电泳时间也有助于大分子蛋白的分离。电泳时使用预染分子量标准品便于实时判断分离情况并及时调整条件。
• 当目标条带彼此过近时，可减少加样体积/蛋白量或降低样品浓度，让泳道更“干净”，条带更细、更易分辨。

Q4：样品停在浓缩/分离胶界面？

• 检查pH：浓缩胶Tris-HCl~pH 6.8、分离胶~pH 8.8；浓缩胶%T不要太高（一般4–5%）；上样缓冲补5–10%甘油提高密度；若仍滞留，降低样品盐度和去垢剂。

Q5：高分子量蛋白在分离胶顶部拥塞？

• 降低%T（如6–8%）、适当提高分离时间并控制温度；上样缓冲确保完全变性/还原；必要时加入6–8 M尿素的SDS-PAGE体系或使用低%C以增大孔径。

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