蛋白质二硫键的精确还原是解析高级结构、开展肽图分析与测序的关键前处理环节；其成败取决于还原体系的选择与控制。常用试剂包括硫醇类DTT与β-巯基乙醇，具还原力适中、应用广泛；对于更高要求的场景，膦类TCEP具备更强还原性、对氧化不敏感且在较宽pH范围内稳定，不含硫醇气味并与烷基化步骤兼容，已成为高端应用的优选方案。

一、硫醇类还原剂

这是最经典和常用的一类还原剂，它们通过自身的硫基（-SH）与二硫键进行硫醇-二硫键交换反应，从而将其打开。

• ​β-巯基乙醇(β-ME)

图一 β-ME化学结构式

特点：挥发性高，具有强烈刺激性气味。

作用机理：单分子可还原一个二硫键，生成混合二硫键与游离巯基；常需过量投加（≈10–50 mM）以推动反应向还原端平衡。

优点：成本低、来源稳定、应用广泛。

局限：气味强烈、易挥发导致实际浓度波动；还原力较DTT/TCEP弱，体系稳定性受pH与氧化影响更明显。

• ​二硫苏糖醇(DTT)

图二 DTT化学结构式

特点：目前应用最广、效力突出的二硫键还原剂之一。

作用机理：分子含两巯基，能与目标二硫键发生巯基交换；自身形成稳定的分子内二硫环，使反应近似不可逆，故效率显著高于β-巯基乙醇。

优点：还原能力强、反应迅速；低用量即可完全还原（常用1–10 mM）。

局限：在碱性pH下易缓慢氧化、活性下降；气味不佳；长期或高浓度暴露可刺激呼吸道黏膜（应在通风条件下操作并做好个体防护）。

• ​三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐酸盐

图三 TCEP化学结构式

特点：高效且稳定的二硫键还原剂，广泛用于蛋白质组学等高要求应用。

作用机理：属膦类还原剂，凭借膦基的亲核作用直接断裂二硫键，生成两端巯基，自身被氧化；不依赖硫醇–二硫键交换，因此反应更快、更彻底。

优点：还原力极强，工作pH范围宽，在酸性条件（pH1–2）仍保持高效；水溶液稳定、不易被空气氧化，通常无需现配；无气味，操作友好；与下游烷基化、质谱等应用高度兼容（不含硫基，不干扰碘乙酰胺/碘乙酸等封闭步骤）。

局限：相较DTT成本更高。

使用提示：避免在磷酸盐缓冲液（PBS）长时间放置中性/碱性条件下使用；若需在PBS中应用，现配现用更稳妥。

二、其他还原剂

在一些特定情况下也会使用。

• ​谷胱甘肽(GSH)

图四 谷胱甘肽化学结构式

特点：内源性三肽（γ-Glu–Cys–Gly），含巯基，是细胞主要还原缓冲成分。

机制：以GSH/GSSG对维持还原环境；可还原二硫键，但亲核性与动力学均弱于DTT/TCEP，常需较高浓度或辅以催化体系。

优点：生理相容、无刺激性气味，对折叠/酶学体系（如PDI参与的重折叠）友好。

局限：还原力与速率偏弱，常引入背景干扰；不适合作为体外蛋白常规处理（如SDS-PAGE前）的主还原剂。

典型用途：细胞/组织氧化还原状态研究、GSH/GSSG重折叠缓冲、特定酶学反应条件控制。

• ​硼氢化钠/氰基硼氢化钠(NaBH4)

图五 硼氢化钠化学结构式

机理：以氢负离子（H⁻）转移直接将二硫键（–S–S–）还原为两端硫醇（–SH），不依赖巯基交换；同时具还原羰基等能力。

特点：反应性强、条件相对“激烈”，可能并行还原蛋白中其他敏感基团。氰基硼氢化钠（NaBH₃CN）反应更温和、选择性更高，常用于温和条件下的还原。

应用：同位素标记→引入²H/³H等同位素（氘化/氚化）用于动力学与结构表征。交联稳定化→在还原胺化中将席夫碱（C=N）还原为稳定的二级胺，用于固化醛基类交联（如戊二醛）或醛基衍生化位点。

使用要点：NaBH₄→常在碱性或缓冲-含醇体系中使用，易与水/酸反应放出H₂；典型1–10 mM起试，低温分批加入以控速。NaBH₃CN→在微酸至中性条件下仍可高效，常5–50 mM；注意强酸条件下潜在HCN释放风险。反应前评估特异性与副反应（如羰基/二硫键以外位点被还原）；必要时优先选择DTT/TCEP等更可控还原体系。

安全与兼容性：全程良好通风，分次添加，避免强酸环境；与后续烷基化/质谱步骤的兼容性需实测确认。

三、还原剂选择与流程

建议流程：

1.还原

• 缓冲体系：6–8 M尿素或4–5 M盐酸胍，pH8.0。
• 还原剂：DTT 5–10 mM或TCEP 2–5 mM。
• 条件：37℃ 10–60 min（需快速彻底变性可至95℃，注意蛋白耐热性）。

2.烷基化

• 目的：封闭–SH，防止二硫键重组。
• 试剂：碘乙酰胺（IAA）20–50 mM（避光）。
• 条件：室温15–30 min，pH 8.0–8.5。
• 终止：少量DTT（≈5 mM）或胺类淬灭过量IAA。

选用提示：

• 常规变性（如SDS-PAGE）：优先用DTT，经济且高效。
• 高要求/需长期保持还原或用于质谱：优选TCEP（更稳定、低气味、兼容性佳）。

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/