还原剂通过断裂并还原肽链与蛋白质中的二硫键来发挥作用。常用二硫键还原剂包括二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇（β-ME）、三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）和2-巯基乙胺盐酸盐（2-MEA）等。对于含有二硫键的蛋白样品，合理使用上述试剂是相关实验顺利进行的关键。

1.DTT

图一 DTT化学结构式

①理化性质

别名：二硫苏糖醇、DL-Dithiothreitol（DTT）；分子式：C₄H₁₀O₂S₂；分子量：154.25；CAS：3483-12-3。为白色固体，密度1.302 g/cm³。室温下溶解度：水中约200 mg/mL，DMSO中约45 mg/mL。

②还原机理

DTT通过巯基-二硫键交换反应实现还原：其自身两端巯基氧化形成分子内二硫键的同时，断裂目标分子的二硫键。该反应受pH显著影响，仅在pH>7时具有有效还原性，原因在于具反应活性的为去质子化的硫醇盐阴离子（-S⁻）；未去质子的硫醇（-SH）活性不足。

图二 DTT还原机理

2.β-巯基乙醇（β-ME）

图三 β-巯基乙醇（β-ME）化学结构式

①理化性质

别名：2-巯基乙醇、2-Mercaptoethanol（β-ME）；分子式：C₂H₆OS；分子量：78.13；CAS：60-24-2。为无色透明液体，密度1.115 g/mL；与水、乙醇等极性溶剂互溶；与部分非极性溶剂的相容性有限。

②还原机理与使用条件

β-ME依靠巯基（–SH）与二硫键（–S–S–）进行巯基-二硫键交换，将二硫键裂解为两个游离巯基，同时自身可形成分子间二硫键。其还原力属中等强度，常用浓度为10–50 mM，SDS-PAGE上样缓冲中通常更高（2–5%v/v）；反应宜在碱性环境（pH>7.5）进行，以确保巯基以硫醇盐（–S⁻）形式存在并保持活性。

③反应方程式为：

2HS-CH2CH2OH+RSSR’→RSH+R'SH+HO-CH2CH2-S-S-CH2CH2-OH

3.TCEP•HCl

图四 TCEP•HCl化学结构式

①理化性质

别名：三(2-羧乙基)膦盐酸盐、Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride（TCEP·HCl）；分子式：C₉H₁₆ClO₆P；分子量：286.65；CAS：51805-45-9。为无色至白色粉末，密度1.041 g/cm³，易溶于水；在pH≈1.5–8.5范围内较稳定。TCEP直接溶于水所得溶液pH约为2.5；在磷酸缓冲液（尤其中性或碱性pH）中稳定性下降，故在PBS中配制后宜即刻使用。

②还原机理

以膦基为亲核体对二硫键发起进攻，实现还原裂解，生成两分子游离巯基（–SH），同时TCEP被氧化为稳定的膦氧化物。

③反应方程式为：

4.2-巯基乙胺盐酸盐(2-MEA)

图五 2-巯基乙胺盐酸盐化学结构式

①理化性质

别名：半胱胺盐酸盐、2-Aminoethanethiol hydrochloride（2-MEA·HCl）；分子式：HSCH₂CH₂NH₂·HCl；分子量：113.61；CAS：156-57-0。为白色结晶性粉末，易溶于水。

②还原机理与适用条件

以巯基（–SH）参与巯基-二硫键交换，将二硫键（–S–S–）还原为两个游离巯基；游离氨基可影响局部结合与微环境pH。2-MEA为温和型还原剂，在碱性条件（pH>8）活性更佳，常用于选择性裂解抗体铰链区二硫键。

图六 2-巯基乙胺盐酸盐还原机理

5.特性对比

6.如何选择？

不同还原剂在化学性质、稳定性及还原强度上各具特点。实验选择应根据目标蛋白结构特征、实验条件（如pH、温度、缓冲体系）及后续操作需求（如标记或纯化步骤）综合考虑。合理搭配与使用还原剂，不仅有助于获得理想的还原效果，也能最大限度地保持蛋白质的天然活性与功能。

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