实验方案（Protocols）

CYT387 JAK1/JAK2 抑制剂实验方案：制备与细胞检测

· · 发布于 2026年10月4日 · 更新于 2026年10月4日 ·

CYT387 is a potent, selective small-molecule inhibitor of JAK1 and JAK2 kinases used in research to interrogate JAK-STAT signaling pathways and evaluate anti-proliferative effects in hematological and solid tumor cell models.

常用名称: Momelotinib（CYT387）
主要靶点: JAK1、JAK2
推荐溶剂: DMSO（储备液）；工作液需用水性缓冲液稀释
典型储备液浓度: 10 mM DMSO溶液
储存条件: -20°C避光防潮保存
实验中DMSO终浓度: 建议≤0.1%（v/v），以避免细胞毒性

材料与试剂

开始实验前，请准备以下材料：

CYT387（货号：C127224）——Aladdin Scientific
无水DMSO（细胞培养级）
适合所用细胞系的完全培养基（例如，用于血液学细胞系的RPMI-1640 + 10% FBS）
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）
目标细胞系（例如，用于骨髓纤维化模型的JAK2-V617F阳性Ba/F3细胞或HEL细胞）
用于通路激活的细胞因子（例如IL-6或IFN-γ，用于STAT磷酸化检测）
细胞活力检测试剂（如MTT、CellTiter-Glo或WST-1）
SDS-PAGE及Western blot相关耗材
抗体：抗磷酸化STAT3（Tyr705）、抗总STAT3、抗磷酸化JAK2、抗总JAK2、抗β-肌动蛋白（内参）
微量离心管（尽量使用低吸附管）
生物安全柜及标准细胞培养设备

储备液配制

按以下步骤在无水DMSO中配制10 mM CYT387储备液：

开瓶前，将CYT387样品瓶在室温下平衡约15–20分钟，以防止粉末上形成冷凝水。
按以下公式计算所需DMSO体积：体积（µL）= [质量（mg）/ 分子量（g/mol）] × 10⁶ / 10 mM。请以货号C127224随附的质量检验报告（CoA）上所注明的精确分子量为准。
将计算所得体积的无水DMSO直接加入样品瓶，立即盖好瓶盖，涡旋混匀30–60秒至完全溶解。如有必要，可在水浴中超声（每次30秒）以助溶。
目视确认溶液澄清均一，若仍有颗粒物残留，请勿继续操作。
将储备液分装为单次使用量（如每管10–20 µL），以减少反复冻融次数。在每个分装管上注明化合物名称、浓度、日期和批号。
将分装管避光、干燥保存于−20°C，并在CoA规定的期限内使用。

注意：若担心析出，切勿一步将DMSO储备液直接以超过1:1000的比例稀释至水性培养基中。请先在37°C预热培养基中进行中间稀释，充分涡旋后再加入细胞。

细胞处理与抑制实验操作步骤

本步骤涵盖JAK-STAT通路抑制检测及细胞活力评估。请根据所用细胞系优化细胞密度及处理条件。

A. 细胞铺板

将细胞以适当密度铺于96孔板（用于活力检测）或6孔板（用于Western blot）。悬浮血液学细胞系的典型起始密度为1–5 × 10⁵个/mL，需根据实验结果进行优化。
在37°C、5% CO₂条件下过夜孵育以使细胞充分平衡。悬浮细胞可直接进行处理。

B. CYT387处理

将10 mM DMSO储备液在完全培养基中进行梯度稀释，制备CYT387工作液。剂量响应实验的典型浓度范围为0.01–10 µM。确保所有实验孔（包括溶媒对照孔）中DMSO终浓度≤0.1%（v/v）。
去除贴壁细胞的原有培养基，向各孔加入含CYT387的培养基（或溶媒对照培养基）。
用于JAK-STAT通路研究时：先用CYT387预处理细胞1–2小时，再进行细胞因子刺激。随后用适当的细胞因子（如20 ng/mL IL-6）刺激15–30分钟。
用于增殖/活力研究时：除非实验设计另有要求，否则无需额外细胞因子刺激，持续用CYT387处理细胞48–72小时。

C. 溶媒对照

务必设置溶媒对照（DMSO终浓度与最高CYT387处理组相同），以区分化合物特异性效应与溶剂效应。

检测结果读取：活力检测与Western Blot分析

细胞活力检测（如MTT / CellTiter-Glo）

处理结束后，按厂商说明书加入活力检测试剂。
使用酶标仪测定吸光度或发光值。
以溶媒对照组（设为100%）为基准，计算各组细胞存活百分比。绘制剂量响应曲线，并使用非线性回归（如四参数逻辑模型）计算IC₅₀值。

JAK-STAT信号通路Western Blot分析

吸去培养基，用冰冷PBS洗涤细胞一次。
在含蛋白酶及磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液中裂解细胞，冰上孵育10分钟，然后在4°C下14,000 × g离心15分钟，收集上清液（蛋白裂解物）。
用BCA法或Bradford法测定蛋白浓度。
每泳道上样20–40 µg蛋白，进行SDS-PAGE电泳，然后转膜至PVDF膜。
用TBST配制的5% BSA封闭液在室温封闭1小时。随后加入一抗（抗p-STAT3 Tyr705、抗总STAT3、抗p-JAK2、抗总JAK2、抗β-肌动蛋白），4°C孵育过夜。
用TBST洗膜（3次，每次10分钟），加入HRP偶联二抗在室温孵育1小时，用化学发光法检测条带。
使用密度分析软件定量条带强度，以总蛋白对磷酸化蛋白进行归一化。与溶媒对照相比，p-STAT3/p-JAK2水平降低证实CYT387的靶点特异性活性。

问题排查与安全注意事项

问题排查

问题	可能原因	建议措施
工作液中出现沉淀	快速稀释至冷培养基中；混匀不充分	将培养基预热至37°C；进行中间梯度稀释；充分涡旋混匀
p-STAT3/p-JAK2未见降低	预处理时间不足；浓度过低；所用细胞系JAK通路未被激活	延长预处理时间至2小时；提高处理浓度；通过细胞因子刺激确认通路基础激活水平
溶媒毒性偏高	实验中DMSO浓度>0.1%	重新计算稀释比例；确保DMSO终浓度≤0.1%；设置匹配的溶媒对照
IC50值不一致	反复冻融导致降解；批次差异	使用单次使用分装管；核实储备液浓度；查阅CoA确认化合物纯度

安全注意事项

CYT387仅供科研使用。操作前请查阅安全数据表（SDS）。
称量或处理高浓度溶液时，请穿戴适当的个人防护装备（实验服、丁腈手套、护目镜）。
DMSO可促进溶解于其中的化合物经皮肤吸收；请尽量避免皮肤接触CYT387/DMSO溶液。
化学废液须按照所在机构及当地政府法规进行处置。

常见问题

配制CYT387储备液的推荐溶剂是什么？

CYT387通常溶解于无水细胞培养级DMSO中，配制10 mM储备液。工作液应在预热的水性培养基中进行稀释，并将DMSO终浓度控制在0.1%（v/v）以下，以避免溶剂相关的细胞毒性。

CYT387抑制哪些信号通路？

CYT387（Momelotinib）选择性抑制JAK1和JAK2激酶，从而抑制下游STAT3和STAT5的磷酸化与激活。这一作用可阻断细胞因子驱动的转录程序，这些程序与细胞增殖和存活密切相关，因此CYT387是研究JAK-STAT通路生物学的重要工具。

如何储存CYT387以保持其稳定性？

CYT387应在−20°C干燥避光条件下储存。为保持药效，应将DMSO储备液分装为单次使用量，避免反复冻融。每次使用前，请让密封样品瓶在室温下充分平衡后再开盖，以防止湿气进入。

体外评估CYT387活性通常使用哪些细胞系？

携带JAK2组成性激活突变的血液学细胞系——如JAK2-V617F阳性细胞系（如HEL、SET-2或工程化Ba/F3-JAK2-V617F细胞）——常用于评估CYT387的抗增殖及信号调控效应。细胞系的具体选择应根据研究问题而定。

如何在实验中确认CYT387的靶点特异性？

最直接的确认方法是通过Western blot检测CYT387处理后与溶媒对照相比JAK2和STAT3（如p-JAK2和p-STAT3 Tyr705）的磷酸化水平。若在总蛋白水平不变的前提下，磷酸化JAK2和STAT3呈剂量依赖性降低，则表明CYT387具有靶点特异性抑制活性。

参考文献

Tyner JW, et al. Identification of coactivating mutations in JAK2-V617F-positive myeloproliferative neoplasms using a cell-based screening system. Blood. 2012. [CYT387/Momelotinib characterization study — verify specific volume, pages, and authorship from primary literature]
Pardanani A, et al. CYT387, a selective JAK1/JAK2 inhibitor: in vitro assessment of kinase selectivity and preclinical studies using cell lines and primary cells from polycythemia vera patients. Leukemia. 2009. [Verify volume, issue, pages, and all author names from primary literature]
Mesa RA, et al. Momelotinib versus ruxolitinib in patients with myelofibrosis (SIMPLIFY-1): a randomised, phase 3 trial. Lancet Haematology. 2017. [Verify full citation details including volume and pages]

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

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探索主题：信号转导细胞活力检测 JAK抑制剂 CYT387 Momelotinib

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。