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DAPI-二乳酸盐染色方案：制备与最佳实践

· · 发布于 2026年10月11日 · 更新于 2026年10月11日 ·

DAPI二乳酸盐是经典DNA结合荧光染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚的水溶性盐型，与游离碱相比具有更佳的水溶性，被广泛用于荧光显微镜、流式细胞术及细胞活力检测中的细胞核复染。

化学形式: DAPI的二乳酸盐；与游离碱相比水溶性显著提高
激发/发射波长: 与DNA结合后激发波长约360 nm，发射波长约460 nm
推荐工作浓度: 固定细胞染色通常为0.1–1 µg/mL，具体浓度需实验验证
储存条件: 置于-20°C干燥避光保存，避免反复冻融
溶解性: 易溶于水及水性缓冲液，通常在水或PBS中配制1–10 mg/mL储备液
产品货号: D1455369 — DAPI二乳酸盐（Aladdin Scientific）

DAPI二乳酸盐概述与染色原理

DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种荧光染料，可优先结合双链DNA富AT序列的小沟，结合后产生强烈荧光信号。二乳酸盐形式（DAPI二乳酸盐）的开发旨在克服DAPI游离碱水溶性差的缺点，使研究人员无需借助DMSO或乙醇等有机溶剂即可在水或磷酸盐缓冲液（PBS）中配制高浓度储备液。

DAPI嵌入DNA小沟后荧光量子产率显著提高，激发峰约360 nm，发射峰约460 nm，使用标准紫外或紫色激光光源即可在暗背景下清晰显示细胞核。由于该染料与DNA呈化学计量结合，也可用于流式细胞术中的定量DNA含量分析和细胞周期研究。

储备液配制与储存

所需材料：DAPI二乳酸盐粉末（货号D1455369）、无核酸酶水或无菌PBS（pH 7.2–7.4）、棕色微量离心管、分析天平。

配制储备液：将DAPI二乳酸盐溶于无核酸酶水或PBS中，浓度为1–10 mg/mL。轻柔涡旋至完全溶解。二乳酸盐无需加热即可轻松溶解。
过滤除菌（可选）：若用于活细胞实验需保证无菌，可通过0.22 µm注射器过滤器过滤。
分装：将储备液分装至小体积（如50–100 µL）棕色或铝箔包裹的管中，以减少光照。
储存：分装液置于-20°C干燥避光保存，妥善储存的储备液稳定性可达12个月。避免反复冻融，以免影响染料性能。

注意：具体溶解度上限及长期稳定性规格请参阅每批次随附的质检报告。

固定细胞荧光显微镜染色操作规程

本方案适用于在染色前已用多聚甲醛或甲醇固定的贴壁或悬浮细胞。

固定细胞：用PBS配制的4%多聚甲醛（PFA）于室温固定细胞15分钟，PBS洗涤3次。
通透处理（如需）：若需共染胞质或细胞核抗原，用PBS配制的0.1–0.5% Triton X-100通透5–10分钟，PBS洗涤3次。DAPI本身可渗入固定细胞，无需专门通透。
封闭（可选）：若进行免疫荧光共染，用PBS配制的1–5% BSA或正常血清封闭30–60分钟。
一抗和二抗孵育：在DAPI复染前完成标准抗体标记步骤。
DAPI复染：将DAPI二乳酸盐储备液用PBS稀释至0.1–1 µg/mL工作浓度，避光于室温孵育细胞5–10分钟。
洗涤：用PBS洗涤3次以去除未结合染料。
封片：用水性防褪色封片剂封片，边缘用透明指甲油密封。
成像：使用紫外或紫色（405 nm）激光通道成像，收集415–480 nm范围内的发射光以获得最佳核信号。

提示：不同细胞类型和固定方法需实验优化DAPI浓度。浓度过高可能导致胞质背景增加。

流式细胞术操作规程与细胞活力评估

DAPI二乳酸盐在流式细胞术中有两大用途：（1）活/死细胞鉴别——DAPI不能穿透完整细胞膜，因此仅对膜受损细胞染色，可用于区分活死细胞；（2）对固定通透细胞进行细胞周期分析。

活/死细胞鉴别

收集细胞，用冷PBS洗涤一次。
用冷PBS将细胞重悬至1–5×10⁶个/mL。
加入DAPI二乳酸盐至终浓度0.1–1 µg/mL，轻柔混匀。
避光冰上孵育5–15分钟。
无需洗涤，立即上机检测（DAPI对活细胞的排斥是可逆的，洗涤可能影响染色结果）。
使用紫外（355 nm）或紫色（405 nm）激光激发，用440–480 nm带通滤光片收集发射光。

细胞周期分析（固定细胞）

用70%冷乙醇于-20°C固定细胞至少2小时。
用PBS洗涤两次去除乙醇。
用RNase A（100 µg/mL，37°C，30分钟）处理，以去除可能非特异性结合DAPI的RNA。
用PBS配制的1 µg/mL DAPI二乳酸盐于室温避光染色30分钟。
上机检测，使用标准软件（如FlowJo、ModFit LT）分析G1、S和G2/M峰。

常见问题排查与安全注意事项

常见问题排查

问题	可能原因	解决方案
核信号弱或无信号	染料浓度不足或孵育时间不够	提高DAPI浓度（最高至1 µg/mL）或延长孵育时间；检查光源/激光对准情况
胞质背景高	染料过量或洗涤不充分	降低工作浓度；增加PBS洗涤次数
活/死细胞检测区分效果差	染色后上机时间过长	染色后30分钟内上机；保持冰浴
流式检测中细胞聚团	重悬不充分	上机前用35–40 µm滤网过滤细胞
荧光溢出至绿色通道	DAPI发射光谱拖尾较宽	进行正确补偿；考虑光谱解混

安全注意事项

DAPI是潜在诱变剂，应按照机构生物安全规程操作。操作时务必佩戴手套、护目镜和实验服。称量粉末时避免吸入粉尘。含DAPI的废液应按当地法规作为有害化学废物处理。完整危害信息请参阅产品D1455369随附的安全数据表（SDS）。

常见问题

DAPI二乳酸盐与DAPI游离碱有何区别？

DAPI二乳酸盐是DAPI的二乳酸盐型，与DAPI游离碱相比水溶性显著提高，可直接用水或PBS配制储备液，无需有机溶剂。两者在溶液中的光谱特性和DNA结合特性基本相同。

DAPI二乳酸盐可用于活细胞核染色吗？

在标准条件下，DAPI通常被认为不能穿透细胞膜，无法有效染色膜完整的活细胞核。因此，DAPI最常用作活/死细胞检测中的死细胞排除染料，或用于固定细胞的核复染。某些特殊方案使用高浓度DAPI进行活细胞染色，但可能具有细胞毒性。

如何为我的实验优化DAPI二乳酸盐的工作浓度？

建议从0.5 µg/mL工作浓度开始，在0.1–1 µg/mL范围内梯度摸索，同时监测信背比。最适浓度取决于细胞类型、固定方法及成像或流式平台。初始优化实验中应设置阴性（不加DAPI）和阳性对照。

DAPI二乳酸盐储备液的稳定性如何？

以单次用量分装后于-20°C避光保存，DAPI二乳酸盐储备液通常可稳定保存12个月。应避免反复冻融。具体稳定性规格请参阅每批次质检报告。

DAPI二乳酸盐与常用防褪色封片剂相容吗？

是的，DAPI与大多数水性和甘油基防褪色封片剂相容。某些树脂基封片剂可能导致染料萃取不均，建议提前验证与所用封片剂的相容性。防褪色试剂有助于长期保存切片时维持DAPI荧光信号。

参考文献

Kapuscinski J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 1995;70(5):220-233.
Invitrogen/Thermo Fisher Scientific. DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) product information. [General reference for DAPI spectral and usage data.]
Aladdin Scientific. Product Certificate of Analysis, DAPI dilactate, SKU D1455369.

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

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Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。