细胞凋亡中Caspase-3活性的检测主要应用于（1）酶的活力测定（2）细胞凋亡指标检测。

操作方法

Caspase-3活性的检测

原理

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

材料与仪器

细胞
磷酸缓冲液 蒸馏水 脱脂奶粉 Caspase-3多抗 吐温 Ac-DEVD-AMC
硝酸纤维素膜 PVDF膜 荧光分光光度计 UV流式细胞计 烧杯 移液管 引流棒

步骤

1、收集细胞；

2、PBS洗涤；

3、抽提细胞裂解液；

4、蛋白定量；

5、SDS-PAGE电泳，硝酸纤维素膜或PVDF膜转移，5%脱脂奶粉封闭，室温1.5——2h或4°C过夜；

6、Caspase-3多抗或单抗室温反应1——2h或4℃过夜，TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5——10min/次；

7、HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1——2h→ TBS-T洗3次， 5——10min/次；

8、ECL显影或NBT/BCIP显色。

注意事项

1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；2.反应完毕后尽快在一小时内检测。

常见问题

1. 结果采用Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

2. 此外还有荧光分光光度计和流式细胞术分析法。

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