构建LacZ融合载体研究酵母菌基因调控。由于这种检测方法简便而且灵敏度高，因此，酵母菌基因经常以LacZ基因的功能 部分作标签，来指示待研究酵母菌基因的表达调节功能。融合蛋白被这样构建：酵母基因的启动子加上这个基因编码蛋白的N端的几个氨基酸残基融合在LacZ基因的羧基 端，由此编码的蛋白质片段仍保持着β-半乳糖苷酶的活性。在构建LacZ融合基因时，关键是基因融合的连接处要保证蛋白质翻译读框的正确性。来源：《精编分子生物学实验指南》第五版

操作方法

利用滤纸提取检测法筛选表达β半乳糖苷酶的酵母菌落

材料与仪器

包含lacZ融合基因的酵母菌株
选择培养基平板 液氮 Z缓冲液 20 mg mL×-gal溶于二甲基甲酰胺
30℃孵育箱 圆形硝酸纤维素滤膜 Whatman 3MM 滤纸

步骤

1)在含有适当选择培养基的培养平板上点接种或者划线接种酵母菌克隆，在30℃培养

直至生长到理想的大小（一般需要48 h)。

设置双份检测有助于提高结果的可靠性。

2)将一个圆形的硝酸纤维素滤膜置于平板上方，轻轻地压在平板的表面，使所有的菌落转移到膜上。这一步建议使用加强型硝酸纤维素滤膜并且要轻轻地操作，因为放在液氮里之后它们会变得非常脆。

3)小心地揭下滤膜，将其置于一装有液氮的浅盘子中，液氮能刚好覆盖一张滤膜即可。

4)使用宽压舌板之类的工具小心地将滤膜从液氮中取出，将滤膜置于干燥的Whatman 滤纸上，在室温解冻（<5min)。

5)将另一张Whatman滤纸剪成圆形，放在一个培养皿里。加入3〜5 mL含有1 mg/mLλ-gal的Z缓冲液，使液体刚好能够浸透滤纸但不能淹没滤纸。把解冻的硝酸纤维素滤膜放在Whatman滤纸上，使缓冲液慢慢地被吸收到滤膜上。

如果Whatman滤纸被缓冲液淹没，会导致菌落扩散，使筛选的结果无法解释。

6)将培养皿放在30℃，温育几分钟至过夜，直到阳性菌落变为蓝色。

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