检测原理

DTNB（Ellman试剂）在弱碱性条件下（pH 7.5–8.5）与游离巯基（–SH）发生化学计量反应。每摩尔巯基还原DTNB中一摩尔二硫键，释放一摩尔发色混合二硫化物和一摩尔TNB²⁻（2-硝基-5-硫代苯甲酸根）。TNB²⁻阴离子呈强烈黄色，在412 nm处具有最大吸收，可用于分光光度定量。

TNB²⁻在水溶液缓冲体系中于412 nm处的摩尔消光系数（ε）约为14,150 M⁻¹cm⁻¹。根据朗伯–比尔定律，由测定的吸光度值计算巯基浓度。

材料与仪器

• DTNB溶液（pH 8.0，10 mM）— 产品编号 D1528838
• 反应缓冲液：0.1 M磷酸钠或Tris-HCl，pH 8.0
• 含巯基样品（蛋白质、肽或小分子）
• L-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽（GSH），用于标准曲线制备
• 能在412 nm处读数的紫外-可见分光光度计
• 比色皿（光程1 cm）或96孔酶标仪
• 移液器及配套吸头（适当量程）
• 计时器

分步操作方案

1. 制备标准曲线

在反应缓冲液（pH 8.0）中配制一系列L-半胱氨酸或GSH标准品（例如0、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 mM）。可根据预期样品巯基浓度调整范围。

2. 建立反应体系

对每个标准品和样品，在比色皿或酶标板孔中加入以下组分：

• 反应缓冲液：补足至终体积1.0 mL（比色皿）或200 µL（酶标板）
• 样品或标准品：10–100 µL
• DTNB溶液（10 mM）：加至终浓度0.5–1.0 mM（例如每1 mL反应体系中加入50–100 µL的10 mM储备液）

同时设置仅含缓冲液和DTNB、不含样品的试剂空白对照。

3. 孵育

轻柔混匀，在室温（25 °C）下避光孵育15–30分钟，直至显色完全。

4. 测定吸光度

以试剂空白为参比，在412 nm处记录吸光度。酶标板格式请在412 nm处以终点法读取。

5. 计算巯基浓度

以A₄₁₂对标准品巯基浓度作图，生成线性校正曲线，通过内插法确定样品巯基浓度。也可直接应用朗伯–比尔定律：C (M) = A₄₁₂ / (ε × l)，其中ε = 14,150 M⁻¹cm⁻¹，l为光程（cm）。

故障排除与操作提示

• 显色弱或无显色：确认样品pH在7.5–8.5之间；DTNB在pH低于7.0时反应效率极低。确保样品在检测前未被氧化。
• 本底吸光度偏高：检查试剂空白是否正确制备。芳香族化合物或除巯基以外的还原剂可能导致本底升高。
• 标准曲线非线性：将高浓度样品稀释至检测线性范围内。
• 蛋白质干扰：对于高蛋白质含量样品，检测前可考虑去蛋白处理（如三氯乙酸沉淀）或稀释。
• DTNB溶液储存：于2–8 °C避光保存，避免反复冻融。若溶液出现浑浊或变色，应丢弃。

安全与操作注意事项

DTNB具有刺激性。操作溶液时请穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、丁腈手套和护目镜。避免吸入及皮肤、眼睛接触。废弃物处置应符合机构及当地法规要求。完整危害信息请参阅产品D1528838随附的安全数据表（SDS）。