荧光素酶作为生物发光检测的核心工具，尽管已被使用数十年，仍不断催生新方法、新应用。近年的两项工作分别从生物分子工程与光学成像工程两端出发，指向同一目标：在同一细胞或同一动物上同时、可分辨地观测两种生物发光信号，从而更精确地解析多基因过程与分子互作的动态。

路线一：光谱可分的双报告，单一底物驱动

Mezzanotte等（PLoS One,2011）采用一红一绿两种以D-荧光素为底物的荧光素酶变体组合：

Ø红色、密码子优化的荧光素酶（Ppy RE8），主发射峰约618 nm；

Ø传统绿色荧光素酶（CBG99），主发射峰约537 nm。

两者以D-荧光素（D-luciferin）作为共同底物，凭借合理的光谱间隔实现信号拆分。关键优势包括：

Ø方法简化：一个底物即可同时驱动两条报告通路，降低加样、时序与兼容性复杂度。

Ø体内适配性更佳：红光在血管化组织中穿透性与抗吸收能力优于蓝光，有利于小鼠等体内成像。

Ø数据配准自然：同一时间点同一底物，减少“先后拍摄”带来的时序偏差。

路线二：光路分束的双通道成像系统

Kwon等（Biotechniques,2010）从成像端着手，将常规CCD相机改造成双通路发光成像系统：

Ø以二向色镜将入射发光按波段分离为“绿通道”和“红通道”；

Ø成像镜头把两束光分别聚焦到CCD不同区域；

Ø单次曝光即可得到两幅同时刻的图像（红/绿），避免滤光片切换引入的时间误差与活体漂移影响。

该策略的实质是以硬件“并行化”取代传统“串行采集”，因此对瞬时动力学、振荡/脉冲式表达或快速转译响应的捕捉尤为有利。

两条路线的互补与可兼容性

将“光谱可分的双报告”与“硬件双通道并行成像”结合，有望获得更高的特异性与时间分辨率：

Ø光谱上，红/绿报告彼此分离，降低串扰；

Ø光学上，分束并行采集，避免序列采集带来的时差；

Ø生物化学上，共用D-荧光素，简化给药与操作流程。

一种从分子发光谱入手，另一种从成像光学入手；二者合力，为“同一细胞/同一动物、同一时刻、可分辨地看见两种生物发光”提供了切实可行的解决方案。选择何种路径，取决于你的实验重点：若重在简化化学体系与体内穿透，偏向红/绿双报告+单一底物；若重在时间同步与动态精度，偏向双通道分束成像；若条件允许，二者结合往往能获得最佳信噪与时间分辨率。

参考文献

1.Mezzanotte, Laura, et al. "Sensitive dual color in vivo bioluminescence imaging using a new red codon optimized firefly luciferase and a green click beetle luciferase." PLoS One 6.4 (2011): e19277.

2.Kwon, HyuckJoon, et al. " Bioluminescence imaging of dual gene expression at the single-cell level." Biotechniques 48 (2010): 460-462.

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/