简介

将目的基因转录调控原件构建到萤火虫荧光素酶报告基因质粒上，与海肾荧光素酶内参基因质粒共转染细胞，裂解细胞后分别加入荧光素酶底物，会发出生物荧光，从而被荧光测定仪读取。

计算萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的相对比值，可以判断对目的基因转录调控原件的影响。

操作方法

双荧光素酶报告基因检测

原理

将目的基因转录调控原件构建到萤火虫荧光素酶报告基因质粒上，与海肾荧光素酶内参基因质粒共转染细胞，裂解细胞后分别加入荧光素酶底物，会发出生物荧光，从而被荧光测定仪读取。计算萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的相对比值，可以判断对目的基因转录调控原件的影响。

材料与仪器

荧光素酶报告基因和内参基因质粒、PBS、细胞裂解液、萤火虫荧光素酶底物
终止液（含海肾荧光素酶底物）（Promega E1910）

步骤

（1） 质粒构建和转染：

构建带有目的序列的萤火虫荧光素酶报告基因，与海肾荧光素酶内参基因质粒共转染细胞，24 h 后可收获样品。

（2） 裂解：

细胞用 PBS 润洗两次后，加入适量细胞裂解液（原液为 5X，用双蒸水稀释至 1X；参考体积：24 孔板每孔加入 100~150 μL，也可按下表适量加入裂解液），反复吹吸细胞，并于摇床震荡裂解 15 min，收集细胞至 1.5 mL EP 管中， 4 ℃ 10000 g 离心 10 min，取上清到新的 EP 管中。

（3） 配置反应底物：

① 配置萤火虫荧光素酶的底物 1（S1）：试剂盒首次使用时即配置，将底物 buffer 加入装有固体底物的棕色瓶中，溶解摇匀，按每次实验需求量（如 1 mL/EP 管）分装于 -80 ℃ 避光保存，使用时室温溶解，同样避光。计算样品数量，按每 50 μL 测定一个样品，分装至 EP 管中。

② 配置海肾荧光素酶的底物 stop&Glo（S2）：每 50 μL stop buffer 加入 1 μL stop substrate。根据样品数量，按每 50 μL 测定一个样品，按需配置。

（4） 测量读值：

取待检测样品 10 μL 加入到 50 μL 反应底物 S1 中，用移液器轻轻吹打数下（注意避免产生气泡），迅速放置仪器中检测（EP 管开盖测量），测得第一个数值（萤火虫荧光素酶活性 S1）。

完毕后迅速将 EP 管取出，加入 50 μL stop&Glo 液，用移液器轻轻吹打混匀，迅速放入仪器中，测得第二个数值（海肾荧光素酶活性 S2）。

上述操作完成后，仪器所显示的二者的比值即为所需数据。

注意事项

（1） 萤火虫荧光素酶底物按需分装以避免反复冻融，-80 ℃ 避光保存，海肾荧光素酶底物现配现用。

（2） 实验前各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要恢复到室温，实验操作过程中注意避光，整个过程尽量在 30 min 内完成，每个样品需充分混匀，并且混匀次数和时间尽量保持一致。

（3） 如果细胞裂解产物需要暂存，常温不超过 6 小时，-20 ℃ 一个月，-80 ℃ 半年。

常见问题

（1） 测量的荧光值较低。首先排除转染效率问题，12 孔板多铺一孔细胞转染荧光质粒，观察转染的荧光效率，并设立阳性和阴性对照。排除转染问题后，如果荧光读值仍然较低，可以尝试增加转染质粒量。

（2） 测量的荧光值过高。减少转染质粒量，或者适当稀释细胞裂解离心后的上清液。

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