背景与作用机制

E-64c是E-64的合成细胞膜透过性类似物。E-64是最初从日本曲霉（Aspergillus japonicus）中分离的天然环氧琥珀酰肽化合物。与不能透过细胞膜的母体化合物E-64不同，E-64c被设计为一种酯类前药，可被动扩散穿过细胞膜，随后在细胞内水解释放活性抑制剂E-64d（又称EST）。

E-64c是半胱氨酸蛋白酶的不可逆共价抑制剂。它选择性烷基化靶蛋白酶活性位点内的催化性半胱氨酸残基，形成稳定的硫醚加合物，从而永久灭活酶的活性。主要靶标包括钙蛋白酶-1（μ-钙蛋白酶）、钙蛋白酶-2（m-钙蛋白酶）、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L。由于E-64c对半胱氨酸蛋白酶的选择性高于丝氨酸蛋白酶和天冬氨酰蛋白酶，它是解析蛋白酶特异性参与细胞凋亡、自噬和溶酶体降解等细胞过程的重要研究工具。

储备液配制

收到产品后或将样品瓶恢复至室温后，立即将E-64c溶于适宜的无水溶剂，制备高浓度储备液。推荐溶剂为无水DMSO或无水乙醇。

1. 确定目标浓度：大多数应用的典型储备液浓度为10–50 mM。操作前请参考具体实验要求。
2. 计算溶剂用量：根据E-64c的分子量，计算达到所需储备液浓度所需的溶剂体积。（注意：请以产品货号E425884随附的质量检验报告（CoA）中的准确分子量为准。）
3. 溶解：向样品瓶中加入计算量的无水DMSO或乙醇，涡旋或短暂超声处理，直至化合物完全溶解，溶液清澈透明。
4. 分装与储存：将储备液分装至微量离心管中，每管为一次性用量。避光保存于−20 °C。避免反复冻融，以免降低抑制剂活性。

溶解性说明：E-64c在DMSO和乙醇中溶解性良好，水溶性有限。如需水相配制，请在使用前立即将DMSO储备液稀释至缓冲液中，细胞实验中DMSO终浓度应≤0.1%（v/v），以避免细胞毒性。

工作液配制与处理方案

使用前将储备液立即稀释至适当的实验缓冲液或细胞培养基中，配制所需工作浓度。由于E-64c是不可逆抑制剂，准确的浓度控制至关重要。

生化（无细胞）实验

1. 将储备液稀释至实验缓冲液（如50 mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5–7.0，或按实验要求配制）中，工作浓度通常为1–100 μM。
2. 在启动底物反应前，将目标酶与E-64c在所需浓度下于37 °C预孵育15–30分钟，以确保活性位点的完全烷基化。
3. 按已验证的实验方案加入荧光或显色底物，启动蛋白酶活性检测。
4. 设置适当的溶剂对照（缓冲液中含等体积DMSO/乙醇）和阳性对照（不含抑制剂的已知活性酶）。

细胞实验

1. 将储备液稀释至预热的完全细胞培养基中，配制所需工作浓度，大多数细胞系通常为10–100 μM。需针对每种细胞类型和应用进行浓度优化。
2. 移去细胞原有培养基，更换含E-64c的培养基；若不便换液，也可直接将E-64c加入原有培养基中。
3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育所需时间（通常为1–24小时），具体时间取决于所研究的生物学过程。
4. 处理结束后，进行下游实验，如针对钙蛋白酶底物的蛋白质印迹（Western blotting）、组织蛋白酶活性检测、自噬流分析或细胞凋亡实验。

储存、稳定性与安全注意事项

储存：将E-64c（货号：E425884）的冻干品或固体形式密封保存于−20 °C，避光防潮。DMSO或乙醇配制的储备液应分装为单次用量，于−20 °C储存，建议在配制后6–12个月内使用。具体储存建议请参阅各批次产品随附的质量检验报告（CoA）。

稳定性：在推荐储存条件下，E-64c干燥固体形式稳定性良好。溶液中，在无水有机溶剂中稳定性最高。水溶液应在使用前新鲜配制，因为酯基随时间可能发生水解，导致抑制剂效价降低。

操作：操作E-64c时应遵守标准实验室安全规范，佩戴手套、实验服和护目镜等个人防护装备，避免吸入粉尘或气溶胶。处理DMSO高浓度储备液时应在通风良好的区域或通风橱中操作。

废弃物处理：E-64c及含其溶液的废弃应按当地机构及相关法规的化学废弃物处理规定执行。

常见问题与排查

• 蛋白酶抑制不完全：确保在加入底物前，抑制剂与酶在37 °C预孵育足够时间（≥15分钟）。核实储备液浓度，并检查是否因储存不当或反复冻融导致降解。
• 细胞实验中出现细胞毒性：降低E-64c工作浓度或缩短处理时间。确保DMSO溶剂终浓度不超过0.1%（v/v）。设置仅含溶剂的对照组，以区分化合物特异性毒性与溶剂相关毒性。
• 溶解性差：确认所用DMSO或乙醇为无水级别。若稀释至水性介质时出现沉淀，可降低储备液浓度，或调整稀释策略（例如先在缓冲液中配制1 mM中间液，再进行最终稀释）。
• 实验间结果不一致：使用从分装储备液中新鲜配制的工作液，避免多次冻融。通过核对每批E425884产品的质量检验报告（CoA）确认批次间一致性。