一、概述与原理

1.1 EMSA基本原理

凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)又称凝胶阻滞实验，是在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis)条件下，检测DNA–蛋白或RNA–蛋白相互作用的经典体外技术。

在非变性条件下:

（1）游离核酸探针以单一条带形式向下迁移；

（2）核酸与蛋白结合形成复合物后，整体分子量和构象发生变化，迁移速度减慢，在胶上形成上移的shift条带；

（3）在结合体系中加入识别目标蛋白的特异性抗体，可形成核酸–蛋白–抗体三元复合物，迁移率进一步降低，出现supershift条带，用于辅助确认结合蛋白成分。

1.2 主要应用场景

（1）研究DNA结合蛋白与特定DNA序列(启动子、增强子、motif等)的相互作用；

（2）比较不同突变探针或不同刺激条件下的结合能力，解析转录调控与信号通路；

（3）对DNA–蛋白或RNA–蛋白结合进行定性或半定量分析，评估亲和力或竞争关系；

（4）结合supershift与质谱，初步锁定复合物中的关键蛋白成员。

1.3 方法学优缺点

（1）优点

1. 灵敏度高:使用放射性标记或高灵敏度非放射性标记探针，可在较低蛋白与核酸浓度下检测结合；
2. 适用范围广:适用于多种长度和结构的DNA/RNA，以及从小肽到大型转录复合物的多类蛋白；
3. 条件可调:缓冲液成分、盐度、pH、温度等可以在较宽范围内优化，方法稳健易于标准化。

（2）局限性

1. 结构信息有限:不能直接解析具体氨基酸位点或精确结合界面，需要与结构生物学技术联合使用；
2. 复杂样本难以直接归因:细胞或组织提取物中存在多种核酸结合蛋白，常需配合supershift、质谱、ChIP等手段明确责任蛋白；
3. 迁移行为受多因素影响:凝胶浓度、电泳条件、核酸长度与序列、复合物电荷与构象等均可改变迁移率，结果解释依赖合理对照设计。

二、样本与试剂准备

2.1 样本类型与建议用量

（1）重组蛋白

1. 每块胶建议重组蛋白总量≥50 μg；
2. 溶解/置换于EMSA兼容的非变性蛋白缓冲液，不得含变性剂；
3. 终浓度建议≥0.2 mg/mL。

（2）细胞样本

1. 细胞量约1×10⁷个或1个10 cm培养皿(细胞密度80–90%)；
2. 按实验目的制备总蛋白或核蛋白提取物，加入蛋白酶抑制剂，全程4 ℃或冰上操作。

（3）动物组织样本

新鲜组织不少于0.2 g，取材后立即低温保存与裂解，降低蛋白降解风险。

（4）植物组织样本

新鲜幼嫩组织不少于0.5 g，常配合液氮研磨成粉后进行蛋白提取。

（5）超迁移实验抗体

用于supershift的目标蛋白特异性IP级抗体，体积不少于10 μL，需验证可识别天然构象蛋白。

（6）一般要求

1. 可使用总蛋白、核蛋白或纯化蛋白，各实验组中加入等量蛋白；
2. 建议蛋白浓度≥100 ng/μL；
3. 蛋白提取物避免反复冻融，必要时分装于−80 ℃，实验用部分短期置于4 ℃。

2.2 关键试剂与缓冲液

（1）非变性PAGE组件

1. 丙烯酰胺/双丙烯酰胺储备液；
2. 适用于分离胶与浓缩胶的Tris缓冲液；
3. APS溶液与TEMED；
4. 0.5×TBE电泳缓冲液。

（2）结合反应组件(需根据体系优化)

1. 10×结合缓冲液:通常含Tris-HCl(pH7.5–8.0)、KCl或NaCl、MgCl₂、DTT、甘油等；
2. 非特异竞争核酸:如poly(dI–dC)或鲑鱼精DNA，用于抑制非特异结合；
3. 标记探针:放射性、生物素或荧光标记寡核苷酸；
4. 冷竞争探针:未标记同序列寡核苷酸；
5. 特异性抗体:用于超迁移反应。

（3）转膜与检测组件(示例:生物素标记探针)

1. 带正电荷尼龙膜；
2. 链霉亲和素–HRP或其他相应显色/发光试剂；
3. 化学发光底物或相应检测体系。

2.3 仪器与耗材

（1）制胶模具与梳子(推荐厚度1.0 mm)；

（2）垂直电泳槽与稳压电源；

（3）37 ℃恒温箱(促进胶聚合)；

（4）转膜装置(湿转或半干转)；

（5）紫外交联仪(如需膜上核酸交联)；

（6）化学发光或荧光成像系统；

（7）RNase/DNase free枪头、EP管及低蛋白吸附耗材。

三、实验步骤

3.1 非变性PAGE制备

（1）模具准备与组装

1. 充分清洗制胶板、垫片与梳子，确保无SDS、DTT等变性剂残留；
2. 按说明书组装制胶板，检查密封性，防止漏胶。

（2）胶液配置与灌注

1. 根据期望分辨率选择丙烯酰胺浓度(常用4–8%)；
2. 按比例混合丙烯酰胺溶液、Tris缓冲液与蒸馏水；
3. 临用前依次加入APS和TEMED，混匀后立即灌胶，尽量避免气泡；
4. 插入梳子，37 ℃静置约1 h，待胶完全聚合。

3.2 结合反应体系配置

建议至少设置如下组别:

（1）阴性对照:探针+结合缓冲液+非特异DNA，不加蛋白，用于显示游离探针位置；

（2）阳性对照:探针+已知结合蛋白，验证体系有效性；

（3）实验组:探针+待测蛋白；

（4）冷竞争组:在实验组基础上加入大过量未标记同序列冷探针，用于验证序列特异性；

（5）超迁移组:在实验组基础上加入目标蛋白特异性抗体，用于检测supershift。

配置顺序建议为:

1. 无核酸酶水或低盐缓冲液；
2. 10×结合缓冲液；
3. 非特异竞争DNA；
4. 蛋白样本，轻柔混匀；
5. 预孵育后加入标记探针。

常见总反应体积为10–20 μL，可根据蛋白浓度与探针信号强度调整。

3.3 样品孵育

（1）预孵育

标记探针加入前，将蛋白、结合缓冲液与非特异DNA混匀，室温孵育约10 min，有助于减少非特异性结合或使冷探针优先占位。

（2）与标记探针结合

加入标记探针后轻轻混匀，室温约25 ℃孵育约50 min，使结合接近平衡。

（3）超迁移反应

进行supershift实验时，可在加入探针前或后加入特异性抗体(根据抗体对初始结合影响而定)，再孵育10–30 min。

3.4 电泳

（1）预电泳

1. 将聚合好的胶装入电泳槽，加入0.5×TBE完全覆盖胶板；
2. 以80 V电压预电泳约10 min，平衡胶体与电泳缓冲液。

（2）上样

1. 取下梳子，用0.5×TBE冲洗胶孔；
2. 向各反应体系加入EMSA上样缓冲液，轻轻混匀；
3. 缓慢上样，避免刺破孔壁或样品溢出。

（3）分离电泳

1. 保持80 V恒压；
2. 监控胶温，建议不超过30 ℃；
3. 当溴酚蓝迁移至胶下缘约1/4处时停止电泳。

3.5 转膜与显影(以生物素标记探针为例)

（1）转膜

1. 按膜材要求预处理带正电荷尼龙膜；
2. 组装转膜夹层时注意排尽气泡；
3. 在合适电流与时间条件下完成复合物转移。

（2）固定与封闭

1. 如需要，可用紫外交联仪对膜上核酸进行交联固定；
2. 将膜置于封闭液中室温封闭30–60 min，降低非特异性结合。

（3）检测

1. 孵育链霉亲和素–HRP或相应检测试剂；
2. 充分洗膜去除未结合酶标物；
3. 加入化学发光底物，使用成像系统曝光成像。

四、结果判读与数据分析

4.1 条带模式

（1）游离探针条带

在阴性对照通道中，可见位于胶下部、迁移最快的窄条带，代表未结合的游离探针。

（2）shift条带

在实验组中，于游离探针之上出现迁移较慢的新条带，为DNA–蛋白或RNA–蛋白复合物。条带强度与结合量相关。

（3）supershift条带

在加入特异性抗体的超迁移组中，可见比shift条带更上移的条带，同时原shift条带减弱或消失，提示抗体识别的蛋白是复合物组分之一。

4.2 特异性判定

（1）冷竞争验证

1. 加入大过量未标记同序列冷探针后，若shift条带明显减弱或消失且游离探针信号增强，提示结合具有序列特异性；
2. 加入无关序列冷探针而shift条带保持稳定，进一步支持特异性结合。

（2）超迁移验证

supershift条带配合冷竞争结果，可较有力地支持目标蛋白参与复合物形成。

4.3 半定量评估

通过梯度改变蛋白用量或探针量，比较shift条带强度与位置变化，可获得结合能力变化趋势；在条件充分标准化的前提下，可对相对亲和力或Kd量级进行粗略估算。

五、常见问题与注意事项

5.1 无明显shift条带

（1）蛋白相关

1. 用SDS-PAGE或Western Blot评估蛋白完整性与表达水平；
2. 确保提取过程全程低温并加入蛋白酶抑制剂，避免降解。

（2）探针相关

1. 用PAGE检查探针完整性与标记效率；
2. 必要时提高探针量或更换标记策略。

（3）体系条件

1. 适度降低盐浓度、调整pH或延长孵育时间；
2. 增加蛋白用量或降低反应总体积以提高有效浓度。

5.2 背景高或条带拖尾

（1）增加非特异竞争DNA用量，抑制非特异结合；

（2）优化结合缓冲液盐浓度与甘油比例，减弱非特异静电作用；

（3）确保蛋白样本中尽可能去除内源核酸等干扰成分。

5.3 分辨率差或条带弥散

（1）适当提高丙烯酰胺浓度或延长电泳时间；

（2）控制电泳温度，避免过热导致带形扩散；

（3）避免上样量过大，特别是复杂样本。

5.4 超迁移实验失败

（1）确认抗体可识别天然构象目标蛋白；

（2）优化抗体用量与加入顺序，防止抗体过量导致复合物不稳定或聚集；

（3）如始终无法获得supershift条带，需考虑蛋白以复合体形式结合或抗体表位被遮蔽等可能，可更换抗体或采用其他互补技术(如ChIP、Co-IP等)进一步验证。

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