直接ELISA：适用于检测基于蛋白质的抗原，并且可以在所需抗体以共轭形式存在时进行。

间接ELISA：如果一抗未结合，则需要。通过间接ELISA，结合二级抗体以一级抗体的特定同型为靶点。

夹心ELISA：测量两层抗体之间的抗原量。待测抗原必须包含至少两个能够与抗体结合的抗原位点。

直接ELISA

抗原应用

1.将100ul抗原溶液和在包衣缓冲液中稀释的校准品标准品（如有）的系列稀释液添加到适当数量的微量滴定孔中。

2.在潮湿环境中，即用玻璃板覆盖或在内部有湿纸巾的密封盒中，在4°C下培养过夜（或在室温下培养2小时）。

3.清空微量滴定孔并倒置平板，将多余的液体轻敲到干净的组织上。

阻塞步骤

4.每口井加入200-300ul封堵液。

5.在室温下孵育10-15分钟，清空平板，将多余的液体轻拍到干净的组织上。

一级抗体培养

6.向每个孔中加入100ul在封闭缓冲液中稀释的一级抗体溶液。

7.在室温下孵化1-2小时或在4°C下轻轻搅拌4小时（例如在摇杆板上）。

8.翻转平板，将多余的液体轻拍到干净的纸巾上。

颜色显影

9.根据一级抗体上结合物的选择开发孔。

所需材料

• 与生物素或HRP结合的一级抗体。

• 包衣缓冲液：抗原标准品通常在pH值为9.5的50 mM碳酸钠中稀释。

• 洗涤缓冲液：典型的洗涤溶液包括中性pH（7.4）下的100 mM PBS或100 mM Tris缓冲盐水，并添加0.05%-0.1%（PBS-T）的洗涤剂，如吐温20或NP-40。

• 阻断缓冲液：阻断缓冲液也用作稀释缓冲液，由PBS-T加阻断剂组成。最常用的阻滞剂是5%牛血清白蛋白或5%脱脂奶粉。

• 一级抗体缓冲液：一级抗体应在封闭缓冲液中稀释，以防止非特异性结合。根据推荐稀释度将抗体稀释至适当浓度。

• 96孔微量滴定板或8孔板条。

• 显色系统（例如TMPT、OPD、酶联亲和素）。

间接ELISA

抗原应用

1.将100ul抗原溶液和在包衣缓冲液中稀释的校准品标准品（如有）的系列稀释液添加到适当数量的微量滴定孔中。

2.在潮湿环境中，即用玻璃板覆盖或在内部有湿纸巾的密封盒中，在4°C下培养过夜（或在室温下培养2小时）。

3.清空微量滴定孔并倒置平板，将多余的液体轻敲到干净的组织上。

阻塞步骤

4.每口井加入200-300ul封堵液。

5.在室温下培养1-2小时，清空平板，将多余的液体轻拍到干净的组织上。

6.用PBS-T洗井三次。

一级抗体培养

7.向每个孔中加入100ul在封闭缓冲液中稀释的一级抗体溶液。

8.在室温下培养1-2小时（或在4°C下培养4小时），轻轻搅拌（例如在摇板上）。

9.翻转平板，将多余的液体轻拍到干净的纸巾上。

10.用PBS-T洗井三次。

二级抗体培养

11.向每个孔中加入100ul在封闭缓冲液中稀释的二级抗体。

12.在室温下温和搅拌培养1-2小时。

13.翻转平板，将多余的液体轻拍到干净的纸巾上。

清洗微量滴定孔

14.用洗涤液（PBS-T）填充每个孔，在室温下搅拌5分钟。

15.倒置培养板，排空剩余液体，并将其轻轻敲出，放在干净的纸巾上。

16.重复清洗步骤3次。

颜色显影

17.将TMB基板添加到每个孔中。用胶带密封并在室温下培养15-30分钟。

18、向每口井中加入停止溶液（2N盐酸或2N硫酸）。轻轻摇晃几秒钟。注：阳性反应的初始颜色为蓝色，加入停止溶液后变为黄色。

19、加入停止溶液后30分钟内，用微孔板读取器读取450 nm处的吸光度。

所需材料

• 一级抗体

• 结合二级抗体（HRP或生物素等）

• 比色底物（如TMB、OPD、酶联亲和素）

• 涂层缓冲液：50 mM碳酸钠，pH 9.5

• 1X PBS（磷酸盐缓冲盐水）：8.0g氯化钠、1.3g二元酸磷酸钠、0.2g一元酸磷酸钠，置于1.0升蒸馏水中，pH值7.4。

• 1X PBS-T（磷酸盐缓冲生理盐水吐温20溶液（PBS-T）：含有0.05%吐温20的PBS。

• 无脂奶粉。

• 封闭缓冲液：PBS-T，5%脱脂奶粉。。

• ELISA 96孔微量滴定板或8孔试纸条。

• 2N盐酸

夹心ELISA

将一级抗体涂覆到平板上

1.在pH值为9.2的0.1M碳酸氢盐缓冲液中稀释捕获抗体。向微量滴定板的每个孔中加入100ul。

2.用塑料薄膜覆盖抗体涂层板，并在含有湿纸巾的潮湿盒子中在4°C下培养过夜，或在潮湿的室温下培养两小时。

3.清空盘子，用PBS清洗3次。

阻塞步骤

4.在室温下，用100ul的封闭缓冲液（含有100mM磷酸盐缓冲液，pH 7.2，1%BSA，0.5%吐温-20）封闭未被占据的部位30分钟。

5.清空平板，用洗涤缓冲液（100mM磷酸盐缓冲液、150mM NaCl、0.2%BSA和0.1%吐温20）洗涤三次。

添加标准和样本

6.在抗原缓冲液（100mM磷酸盐缓冲液、150mM氯化钠）中稀释抗原溶液。以每孔100ul的体积加入板中。将平板在室温下培养45-60分钟。

7.再次清空盘子。用洗涤缓冲液洗涤三次。

二级抗体培养

8.在封闭缓冲液中适当稀释酶标记抗体。向每个孔中加入100ul，并在室温下培养30分钟。

9.再次清空盘子。用洗涤缓冲液洗涤三次。

10.翻转平板，将多余的液体轻拍到干净的纸巾上。

颜色显影

11.添加显色系统（如TMPD、OPD）并在适当波长下测量吸光度。

所需材料

• 一级抗体

• 针对相关抗原的共轭（例如HRP、生物素）二级抗体。

• 比色底物（如TMB、OPD、酶联亲和素）

• 涂层缓冲液：50 mM碳酸钠，pH 9.5

• 1X PBS（磷酸盐缓冲盐水）：8.0g氯化钠、1.3g二元酸磷酸钠、0.2g一元酸磷酸钠，置于1.0升蒸馏水中，pH值7.4。

• 洗涤缓冲液：1X PBS-T（磷酸盐缓冲生理盐水吐温20溶液（PBS-T）：含有0.1%吐温20的PBS。

• 无脂奶粉。

• 封闭缓冲液：PBS-T，5%脱脂奶粉。。

• ELISA 96孔微量滴定板或8孔试纸条。

• 2N盐酸