简介
          埃尔曼试剂，5,5′-二硫双（2-硝基苯甲酸），又称 DTNB，是一种水溶性化合物，在微碱性条件下与溶液中的游离巯基反应，生成混合二硫化物和高发色性的 5-硝基-2-硫代苯甲酸（TNB），在 412 纳米波长下的摩尔消光系数（摩尔吸收率）为 14.15 mM-1cm-1。

          这是 BroadPharm 公司制定的标准方案，用于测定小肽和蛋白质中的游离硫醇，游离硫醇通常处于还原状态，在酸性溶液中对氧化稳定。在将 Fab'片段和硫醇化抗体与含有马来酰亚胺的脂质体连接之前，需要进行埃尔曼检测。

使用半胱氨酸标准品对巯基进行定量 
          1. 配制 pH 为 8.0 的 0.1 M 磷酸钠缓冲溶液（反应缓冲液）。
          2. 在反应缓冲液（埃尔曼试剂溶液）中溶解 4 mg/mL 的埃尔曼试剂，5,5′-二硫双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）。
          3. 在反应缓冲液中溶解 5.268 毫克半胱氨酸盐酸盐一水合物（MW = 175.6），初始浓度为 1.5 毫摩尔（下表中的标准 A）。根据下表，按顺序稀释标准 A，制备一组半胱氨酸标准品。
          4. 在每个标准品中加入 50 µL 的埃尔曼试剂并充分混合。
          5. 室温下孵育 15 分钟。
          6. 在 412 纳米波长下测量吸光度。
          7. 绘制每种标准品的吸光度值与半胱氨酸浓度的关系曲线（校准曲线），并根据 曲线确定样品中游离巯基的浓度。

利用消光系数计算巯基定量 
          1. 配制 pH 值为 8.0 的 0.1 M 磷酸钠缓冲溶液（反应缓冲液）。

          2. 将 4 毫克埃尔曼试剂溶于 1 毫升反应缓冲液（埃尔曼试剂溶液）中。

          3. 为每个样品准备两个试管，分别装有 25 µL 的埃尔曼试剂溶液和 1.250 mL 的反应缓冲液。

          4. 在步骤 3 准备好的试管中加入 0.125 µL 未知样品。

          5. 在步骤 3 中准备好的另一支试管中加入 125 µL 反应缓冲液，制备空白样。

          6. 混合均匀并在室温下培养 15 分钟。

          7. 将分光光度计对准 412 纳米波长处的空白，测量样品的吸光度。

          注：高浓度（>1 mM）的游离巯基由于吸光度值较高，可能会降低巯基浓度测量的准确性。在这种情况下，建议稀释样品溶液，使 0.1786 mL 等分样品中的游离巯基含量低于 1 mM。

计算游离巯基浓度

A= ƐbC 

          其中
          A：412 纳米波长的吸光度；
          b 是路径长度（厘米）、
          C 是分光光度计比色皿中溶液的浓度（M）。
          Ɛ: 摩尔吸收率

举例说明：

          用 1 厘米分光光度计比色皿将 125 微升等分的未知样品与 1.250 毫升反应缓冲液和 25 微升埃尔曼试剂溶液混合，得到 0.750 的吸光度（减去空白）。计算每毫升未知样品中的巯基浓度（以微摩尔为单位）。

          0.75= 14150*1*C

          C=5.300x 10-5 M (mol/L)

要计算样品中的巯基浓度，需要化验总体积和游离巯基的总摩尔数。

          V total = V reaction-buffer + V Ellman_ Reagent_Buffer+ Vsample

          V total=1.25+ 0.025+0.125=1.4ml

因此，等分样品中的巯基摩尔数：

          1.4×10-3× 5.3×10-5 = 7.42× 10-8 mol 

由于化验溶液只含有 0.1786 mL 的原始样品。原始样品中游离巯基的浓度可按下式求得：

          C sample = 7.42× 10-8 /(0.125×10-3 )

                            =5.92× 10-4 M

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