内毒素（endotoxin）通常指革兰氏阴性细菌外膜外层富集的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。在重组蛋白表达与纯化流程中，尤其是以大肠杆菌等宿主来源的样品，LPS既可能以内源性杂质形式伴随蛋白共纯化，也可能在操作与耗材环节发生外源性引入。由于LPS具有显著的免疫刺激活性，内毒素控制是治疗性蛋白、诊断试剂及细胞相关实验用蛋白的重要质量属性。工程上可利用LPS在电荷、两亲性疏水结构、聚集尺寸及与蛋白相互作用模式方面的特征差异，通过层析、相分离与膜分离等手段实现分离，并以过程采样与方法学验证确保终产品满足目标限度。

         关键词：内毒素；脂多糖；去热原；蛋白纯化；离子交换；疏水作用；TFF；特异吸附

一、引言

         在蛋白药物开发与科研级蛋白制备中，“高纯度”并不等同于“低内毒素”。LPS可在较宽的条件窗口内保持结构与活性，并可通过静电、疏水或桥联离子作用与蛋白或基质发生非特异结合。因此，内毒素去除通常需要作为独立的质量目标嵌入纯化流程，而不是依赖单一步骤“顺带完成”。

二、内毒素的结构与关键理化特征

2.1 结构组成与生物活性位点

（1）脂质A：主要免疫刺激基团

        LPS的脂质A部分位于分子疏水端，含磷酸基与脂肪酸链，是触发多种炎症与发热反应的关键结构单元。不同细菌脂质A的脂肪酸链数、长度与磷酸化状态存在差异，但其“带负电的两亲性疏水骨架”是普遍特征。

（2）核心寡糖与O-特异多糖：决定抗原特异性

        核心寡糖连接脂质A与外侧的O-特异多糖（O-抗原）。O-抗原由重复寡糖单元组成，其组成与排列决定菌株的血清型差异，并可影响LPS的溶液行为与与基质的相互作用强度。

2.2 两亲性、负电荷与聚集行为

（1）溶液中常以胶束或囊泡样聚集体存在

        由于脂质A疏水端与多糖亲水端并存，LPS在水溶液中倾向于形成胶束、囊泡或更大的聚集体，而非长期以单体均一分散。聚集尺度受pH、离子强度、温度以及表面活性剂等因素影响。

（2）二价阳离子可稳定聚集体并增强基质结合

        LPS含磷酸等阴离子基团，整体呈负电性。Ca2+、Mg2+等二价阳离子可在相邻LPS分子间形成电荷屏蔽或“桥联”，提升聚集体稳定性并可能增强其在带正电或疏水表面的吸附倾向。

（3）表观分子量高度可变是去除难点之一

        LPS单体分子量通常在10–20 kDa量级，但其聚集后表观分子量可上升到数百kDa甚至更高。这种尺寸异质性意味着“按分子量截留”在不同缓冲体系与不同蛋白背景下的效果差异很大。

2.3 稳定性边界与“灭活”误区

（1）常规湿热灭菌不等同于去热原

        LPS并非蛋白质，其热稳定性显著高于多数蛋白。因此，常规高压蒸汽灭菌可有效灭活微生物，但并不能可靠降低器具或溶液中的内毒素活性。工程上常将干热去热原（例如180 ℃数小时或250 ℃约30分钟级别的处理）作为玻璃器皿去热原的经典方案之一。

（2）强酸、强碱与强氧化剂可破坏活性但不适用于蛋白体系

        强酸、强碱或强氧化剂在适当条件下可显著降低LPS活性，但这些条件通常会同时导致蛋白变性、修饰或降解。因此，蛋白纯化中的内毒素控制更依赖“分离去除”而非“化学灭活”。

三、内毒素控制的总体框架

3.1 外源性污染的过程控制

        建议从水系统、缓冲液配制、一次性耗材与器皿清洗四个环节降低外源性引入风险。典型措施包括使用经验证的低内毒素水与缓冲体系、对关键器具执行去热原处理、在可控洁净环境中进行开放操作，并对易吸附LPS的塑料耗材进行适用性确认。

3.2 以内毒素与目标蛋白差异为核心的去除逻辑

        工艺选型应基于目标蛋白的等电点、疏水性、寡聚状态与稳定性窗口，同时评估LPS与蛋白之间是否存在强相互作用（如疏水插入或静电复合）。一般而言，离子交换用于利用电荷差异，疏水相关方法用于利用脂质A的疏水端，相分离用于重分配两亲性杂质，膜分离用于利用聚集尺寸差异，而特异吸附介质用于最大化选择性。

3.3 监测与方法学注意事项

        内毒素检测常以鲎试剂法（LAL）或同类方法为基础，结果以EU/mL或EU/mg表述。在高盐、含去污剂或高蛋白浓度体系中，检测可能出现抑制或增强效应，应通过加标回收、稀释窗口与干扰评估建立可用的检测条件，并将关键节点的过程采样纳入放大验证。

四、常用去除方法与工艺要点

4.1 离子交换层析（AEX/CEX）

（1）阴离子交换：内毒素捕获或蛋白流穿模式

        LPS在多数工艺pH条件下呈负电性，可与带正电的阴离子交换介质发生较强结合。当目标蛋白在该pH下整体为正电或不易与介质结合时，可采用“蛋白流穿、内毒素结合”的操作模式；若目标蛋白也需在AEX上结合，则可通过优化盐梯度与洗涤条件，利用LPS更强的多点结合特征实现分离。

（2）阳离子交换：蛋白结合、内毒素流穿的常用策略

        在pH低于目标蛋白等电点的条件下，蛋白带正电并可结合于阳离子交换介质，而LPS通常不与该介质发生有效结合并随流动相流出。该策略在“捕获或中间纯化步骤”中较常用，可在保证收率的同时显著降低内毒素负荷。

（3）洗涤与再生：高盐与碱洗用于降低记忆效应

        由于LPS易造成填料表面“记忆效应”与后续批次交叉污染风险，建议将高盐冲洗与适度碱洗纳入再生方案，并验证再生对填料性能与配基稳定性的影响。

4.2 疏水作用相关方法（HIC/疏水吸附）

（1）利用脂质A疏水端增强吸附，实现选择性分离

        在高盐条件下，疏水作用增强。LPS的脂质A疏水端使其在多类疏水填料上具有较强吸附倾向。若目标蛋白整体疏水性较弱，可采用“蛋白流穿、内毒素吸附”的模式；若蛋白也会结合，则需通过盐浓度、添加剂与洗涤/洗脱程序共同优化，以避免蛋白变性或收率下降。

（2）盐浓度窗口需要与蛋白稳定性协同优化

        HIC通常需要较高离子强度，可能引起部分蛋白聚集或构象变化。建议在小试阶段同时评价内毒素去除率、目标蛋白活性/聚集体比例与后续步骤兼容性，避免将内毒素去除建立在不可放大的条件上。

4.3 去污剂相分离（以Triton X-114为例）

（1）云点分相实现LPS向去污剂富集相转移

        部分非离子去污剂在升温后会发生“水相-去污剂相”分相。由于LPS两亲性结构可更倾向分配至去污剂富集相，经过一次或多次萃取可显著降低水相（或蛋白相）内的内毒素含量。

（2）后处理需控制去污剂残留与蛋白活性影响

        相分离法的关键风险在于去污剂残留与温度升高对热敏感蛋白的影响。通常需要结合透析、TFF置换或后续层析步骤去除去污剂，并在方法学上验证残留水平与蛋白功能保持。

4.4 凝胶过滤层析（SEC）

（1）以聚集体尺寸差异为驱动的抛光策略

        当LPS以较大聚集体形式存在且目标蛋白分子量明显更小（或更大）时，SEC可提供一定的分离能力。但SEC处理量小、周期长，更适合作为抛光步骤或用于分析性评估，而非高负荷的主力去除手段。

4.5 膜分离与切向流（UF/TFF）

（1）透过式分离：适用于小分子蛋白/肽类的“蛋白透过”场景

        当目标分子明显小于LPS聚集体时，可选择合适孔径使目标分子透过而截留聚集体，从而实现物理分离。该模式需要在收率、膜吸附与聚集体解离风险之间进行权衡。

（2）截留式分离：以透析置换降低可迁移内毒素

        在更常见的“蛋白截留”TFF模式下，内毒素是否能随透过液移除取决于其解离程度以及与蛋白/缓冲组分的相互作用。通过调节离子强度、引入温和去污剂或竞争性配体，有时可提高内毒素的可迁移性；但该方法的可重复性需通过实验数据验证。

4.6 特异性吸附介质（内毒素去除填料）

（1）配基特异结合脂质A，获得高选择性

        多粘菌素B等配基可与脂质A发生特异相互作用，相关去除填料通常可在不显著改变蛋白缓冲条件的情况下实现较高去除效率。

（2）关注配基渗漏、蛋白损失与放大一致性

        特异吸附介质的风险点包括配基渗漏、对特定蛋白的非特异吸附以及在高蛋白负荷下容量下降。建议通过回收率、容量曲线与渗漏检测建立放大设计空间，并评估其与后续步骤的兼容性。

4.7 亲和层析捕获蛋白的间接去除效应

（1）高选择性捕获可降低共纯化概率

        当亲和层析对目标蛋白具有高选择性时，多数非特异杂质（包括部分LPS）会在上样或洗涤阶段被带走。但LPS仍可能通过非特异吸附与蛋白复合而随蛋白洗脱，因此亲和层析更适合作为降低负荷的步骤，而非单独依赖的终端保障。

4.8 方法对比与选型提示

        下表从分离驱动力、适用场景与关键风险三个维度对常用策略进行概括，便于在不同蛋白属性与工艺约束下快速筛选候选方案。

五、工艺组合与验证建议

5.1 组合策略：从“降负荷”到“终端保障”

（1）先降低内毒素负荷，再做高选择性抛光

        对于起始内毒素水平较高的样品，通常先用离子交换或去污剂相分离等手段降低负荷，再使用特异吸附介质或抛光层析进行终端控制，整体更易获得可重复结果。

（2）将蛋白性质作为核心约束条件

        高pI蛋白更适合采用AEX流穿模式；低pI蛋白可优先考虑CEX捕获并在洗涤阶段削减LPS。若蛋白与LPS存在强疏水复合，需评估去污剂或竞争性条件以打破相互作用，再进行分离。

5.2 放大与可验证性：将内毒素作为过程质量属性管理

         建议在关键步骤（裂解澄清后、捕获后、中间纯化后、终端抛光后）设置内毒素检测点，并同步记录pH、导电率与温度等过程参数。对用于生产的填料与膜，应验证清洗再生方案的有效性，并通过批间数据评估长期趋势，避免在放大阶段出现“去除率漂移”。

         内毒素去除不存在对所有蛋白都通用的一步法方案。建立对LPS结构、聚集行为与相互作用机制的结构化认识，并据此在离子交换、疏水作用、相分离、膜分离与特异吸附之间进行组合设计，通常比单一方法更能获得稳定、可放大的工艺表现。在此基础上，将内毒素作为过程质量属性进行监测与方法学验证，是确保终产品满足目标限度与使用安全边界的关键。

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