胃蛋白酶的酶法测定
胃蛋白酶的酶法测定
描述
本方法可用于以血红蛋白为底物的胃蛋白酶活性测定。这是一种分光光度速率终止测定法。
单位定义：一个单位的胃蛋白酶在37℃、pH2.0下，以血红蛋白作为底物，溶于三氯乙酸（TCA）的产物每分钟产生0.001的ΔA280。（最终体积=16mL，光程=1cm。）
所需试剂和设备
1.0M 盐酸
牛血血红蛋白（产品号：H195714）
6.1N [~100% (w/v)] 三氯乙酸溶液（产品号：A291718）
注意事项
请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。
制备说明
使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。
10 mM HCl（盐酸）——用超纯水将1.0M盐酸稀释100倍。
2.5% (w/v) 血红蛋白原液——使用牛血血红蛋白用超纯水配制25mg/mL溶液。用力搅拌，形成漩涡，在37°C下至少持续搅拌10分钟，然后用粗过滤器（90-130 mm）通过聚丙烯柱过滤。
底物[2.0% (w/v)血红蛋白溶液]——将80mL过滤后的2.5% (w/v) 血红蛋白原液转移到合适的容器中。使用5M HCl在37°C下将溶液的pH调至2.0。用超纯水将最终体积加至100 mL。
TCA溶液[5% (w/v)三氯乙酸]——用超纯水稀释6.1N[~100% (w/v)]三氯乙酸溶液20倍。
酶溶液（胃蛋白酶）–用冷的(2-8°C) 10mM HCl制备1mg/mL的原液。如果存在不溶物质，将原液置于冰上直至溶解。如果胃蛋白酶（产品号：P128678）已经溶解，或者如果不溶性物质仍然存在，在1小时后，将1mg/mL的原液用冷的10mM HCl溶液进一步稀释至0.01–0.05 mg/mL。
操作流程
1.将底物移入合适的玻璃瓶中。
试剂 | 空白(ml) | 试样1(ml) | 试样2(ml) | 试样3(ml) |
底物 | 5.00 | 5.00 | 5.00 | 5.00 |
2.将小瓶置于恒温水浴中并平衡至 37°C约10分钟，然后添加：
试剂 | 空白(ml) | 试样1(ml) | 试样2(ml) | 试样3(ml) |
酶溶液 | – | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
3.涡旋混合并在37ºC孵育整整10分钟，然后添加：
试剂 | 空白(ml) | 试样1(ml) | 试样2(ml) | 试样3(ml) |
三氯乙酸溶液 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 |
酶溶液 | 1.00 | – | – | – |
4.涡旋混合并在37°C下再孵育5分钟。
5.通过0.45µm注射过滤器过滤空白和试样混合物。使用分光光度计，记录每个小瓶中每种过滤溶液相对空气的A280。
结果
计算
单位/ml 酶= (A280 试样– A280 空白) x (df)
(10) × (1.0) × (.001)
式中：
df =稀释因子
10 =以分钟计的测定孵育时间
1.0 =添加的酶溶液体积(ml)
0.001=每单位胃蛋白酶（单位定义）的ΔA280
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