人肝恶性淋巴瘤裸小鼠原位和皮下移植模型的建立可以：

（1）探讨肝恶性淋巴瘤发病机制；（2）为实验治疗提供工具；

（3）为肝脏恶性淋巴瘤病因学和发病机制提供实验研究用的肿瘤动物模型。

操作方法

原位及皮下移植模型

原理

采用人肝恶性淋巴瘤术中新鲜组织块分别植入裸小鼠肝实质内和肩胛间皮下, 观察原位移植和皮下移植成瘤率, 移植瘤的侵袭、转移；并进行形态学( 光镜、电镜、免疫组织化学) 、血清学[ 甲胎蛋白( AFP) 、乙型肝炎病毒表面抗原( H BsAg) 、乳酸脱氢酶( LDH) ] 检测，染色体核型和流式细胞分析。

材料与仪器

BALB C-nu nu 裸小鼠 肝恶性淋巴瘤新鲜标本
RPMI-1640 培养液 碘酊 酒精 在戊巴比妥钠 CD3抗体 CD7抗体 CD19抗体 CD20抗体 CD45RO抗体 CD79a 抗体
丝线 光学显微镜 套管针 手术刀 纱布

步骤

一、实验动物准备

BALB/C-nu/ nu 裸小鼠，鼠龄4~ 6 周，体重17~ 20 g， 雌雄兼用，在无特定病原体( specific-pathogen free，SPF) 条件下本院裸鼠室内饲养。
二、标本来源

1.  肝恶性淋巴瘤新鲜标本来自1 例53 岁男性患者，术前实验室检查除LDH 升高( 1 200 U / L) 、HBsAg 阳性外，肝功能、AFP、CEA 和骨髓象均正常。

2.  手术证实为肝多发结节型淋巴瘤，肝脏右叶呈多发性瘤结节，左叶由多个瘤结节融合为5. 3 cm x3. 5 cmx 3. 0cm 肿块，切面灰白色鱼肉状， 结节中间部分黄白色，周边有红色不规则的充血带。

3.  术中未见其他组织、器官侵犯或远处淋巴结被累及，取肝左叶肿瘤结节病理诊断为肝脏非霍奇金B 细胞源性恶性淋巴瘤；慢性肝炎。

三、标本处理

无菌切取的人肝恶性淋巴瘤活体瘤组织， 置入RPMI-1640 培养液中， 清除非瘤组织， 将其剪切成1 mm x1 mm x1 mm 组织小块，供移植用。

四、皮下移植

用2. 5% 碘酊和75% 酒精消毒裸鼠背部皮肤，用无菌套管针抽吸2 粒1 mm  x1 mm  x1 mm瘤组织块， 行颈背部皮下组织移植。

五、原位移植

1.  裸鼠在戊巴比妥钠( 30 mg/ kg ) 静脉注射麻醉下， 取左上腹横切口， 暴露肝脏， 切开肝左叶被膜， 将2 块1 mm x1 mm x1 mm 瘤组织块植入肝实质内，10-0 无损伤线缝合肝被膜，7-0 丝线缝合腹膜， 5-0 丝线缝皮。

2.  术后，继续饲养， 逐日观察肿瘤生长情况。

六、传代

1.  当荷瘤裸鼠处于濒死状态时，取其中一只荷瘤裸鼠用颈椎脱位术处死， 系统解剖，取出移植瘤。

2.  取出的移植瘤一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续传代， 每次传代裸鼠5~10 只不等； 另一部分瘤组织液氮冻存备用，并被用做相关指标检测。

3.  其他荷瘤裸鼠饲养至濒死状态或自然死亡，以观察其肿瘤的生长、侵袭和转移。

七、 观察项目

  1.   解剖学和组织学检查

（1）全部被处死和自然死亡的荷瘤裸鼠均经详细解剖学检查， 并记录肝内肿瘤，皮下移植瘤生长情况。

（2）淋巴结取材包括：髂动脉旁、髂动脉间、纵隔、肠系膜、幽门、贲门和肝门淋巴结等； 肺、肝、脾、肾、脑等器官常规取材，所有组织均经10% 中性甲醛固定， 石蜡切片，苏木精、伊红( H E) 染色， 光镜观察。

2.  免疫组织化学染色

采用LSAB 法，对全部裸鼠肝肿瘤切片用CD3、CD7、CD19、CD20、CD45RO、CD79a 抗体进行免疫组织化学染 色，所用试剂均购自DaKo 公司。

  3.  电镜观察

移植瘤组织以2. 5% 戊二醛和1% 锇酸双固定， Epon-812 包埋， 超薄切片，铀- 铅染色，PHILIPS-CM10透射电镜观察。

  4.  实验室检查

 AFP 放免法； 乙肝标志：HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAgELISA 法； LDH-L 法。

  5.   流式细胞分析

采用美国FACS-420型流式细胞仪， 对正常肝细胞、瘤源标本、移植瘤细胞进行DNA 含量测定。

  6.   染色体检查

采用短期培养，不加有丝分裂刺激方法，收获细胞常规制片，GTG 法染色，显微镜下观察。

  7.   恶性淋巴瘤组织学分类标准

采用2001 年新的WHO 分类方法。

8.   统计学处理

 差异显著性采用t 检验, 数据以以x±s 表示，在SPSS10. 0 统计软件上完成。

注意事项

正是由于裸鼠肝微环境与人肝相似 ,使植入的肿瘤出现类似于人肝原发性恶性淋巴瘤体内的播散过程 ,为肝原发性恶性淋巴瘤的基础和临床研究提供了理想的动物模型平台

常见问题

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