本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线，即在酶反应的最适条件下，每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标，画出酶反应的时间进程曲线。

操作方法

二硝基水杨酸法

原理

酶反应的时间进程曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长，曲线斜率不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围内进行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。

材料与仪器

蔗糖
乙酸缓冲液 葡萄糖 二硝基水杨酸溶液
分光光度计 水浴锅 试管 保鲜膜

步骤

1 .准备12 支试管，按表2 进行测定。用反应时间为0 的第一管作空白对照, 此试管要先加0.1 mol/ L NaOH 后加酶。第10支试管是校正蔗糖的酸水解。用第11 管作为对照，测定第12 管葡萄糖标准的光吸收值，用以计算第2～9 各测定管所生成还原糖的μmole 数。

2 .表2 中底物蔗糖的量为每管0.25 μmol 全部反应后可产生0.5 μmol 的还原糖，所有的蔗糖和酶浓度应使底物在20 min 内基本反应完。

3 .画出生成的还原糖的 μmol 数（即产物浓度 μmol/ ml）与反应时间的关系曲线，即反应的时间进程曲线，求出反应的初速度。

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