1.如何选用特殊细胞系培养基？

培养某一类型细胞通常没有唯一固定的培养条件，不同实验室可能略有差异，一般在无明确说明时，贴壁细胞常以MEM、DMEM等基础培养基作为起点，悬浮细胞常选用RPMI 1640等，某些细胞在MEM中可以生长，也可能在DMEM或M199中生长良好，因此应优先参考细胞来源单位或原始文献的推荐条件，如确需更换培养基，应采用逐步过渡而非突然完全更换的方式，让细胞有时间适应。

2.自己新配制的液体培养基能保存多久？

新配制并过滤除菌后的培养基建议置于4℃避光保存，一般在一周内使用完毕为宜，因为培养基越新鲜，成分（尤其是部分维生素和氨基酸）越稳定，更有利于细胞状态和实验重现性，如需较长时间使用同一批次培养基，可分装小瓶以减少反复开合和温度波动。

3.培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？

在新鲜培养基中加入血清和抗生素后，一般建议于4℃避光条件下在1–2周内使用完毕，因为部分抗生素以及血清中的热不稳定成分在解冻或液体状态下会逐渐降解，贮存时间过长可能导致抗生素效力下降、血清成分发生变化，从而影响细胞生长和实验结果的可重复性，因此宜按实际需求分装和配制完全培养基。

4.培养基中是否必须添加抗生素？

常规细胞培养中并不建议长期依赖抗生素，除非是用于特定筛选体系或处于污染高风险环境，一般不必常规添加；如需暂时预防细菌和真菌污染，可加入青霉素-链霉素（双抗）溶液，使终浓度为青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，但长期使用抗生素容易掩盖低度污染并对细胞造成应激，因此良好的无菌操作习惯才是防控污染的根本。

5.液体培养基可以放-20℃保存吗？

不推荐将液体培养基直接长期保存于-20℃，因为在-20℃下冻存和反复冻融时，培养基中的无机盐和部分成分容易析出结晶，解冻后可能难以完全重新溶解，从而导致培养基渗透压和离子平衡发生变化，造成细胞应激甚至死亡；若确需冷冻保存，一般是冻存高浓度添加剂或使用厂家已经验证可以冻存的专用配方，而不是普通现成液体完全培养基。

6.为何培养基保存于4℃冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值越来越偏碱性？

以NaHCO₃/CO₂为主要缓冲体系的培养基在4℃冰箱中保存时，体系中的CO₂会逐渐逸出，碳酸氢盐平衡因而向碱性方向偏移导致pH升高，作为pH指示剂的酚红在pH偏碱时颜色由橙红逐渐变为暗红甚至偏紫，因此可观察到颜色变深；若培养基长期偏碱，细胞生长会停滞甚至死亡，如发现明显偏碱，可在无菌条件下缓慢通入无菌过滤后的CO₂，将pH调整回适宜范围，再继续使用。

7.为什么液体培养基1640颜色发黄，是pH值不对吗？

RPMI 1640培养基本身为低酚红浓度配方，其酚红含量大约为DMEM的四分之一，因此基础颜色会较浅，呈现偏黄或黄橙色，这种颜色往往是配方本身所致，并不一定意味着pH出现异常，只要pH经测定在7.2–7.4的正常范围内，即可认为培养基pH正常，若有疑虑可结合pH计或指示试纸进行确认。

8.培养液pH是怎样影响细胞生长的？

大多数哺乳动物细胞在37℃条件下适宜的pH范围约为7.2–7.4，偏离该范围会对细胞造成应激甚至损伤，通常原代细胞对pH变动的耐受性较差，而无限传代细胞系的耐受性相对较强，总体上细胞对轻度酸性环境的耐受往往优于明显偏碱环境，偏碱更容易抑制生长甚至导致细胞死亡，因此配制培养液时可以将pH略微调低至偏酸端（如7.1–7.2），因为经过0.1 μm或0.2 μm滤膜过滤以及在CO₂培养箱中平衡后，pH往往会略有上升，最终稳定在7.2–7.4的适宜范围内。

9.培养液渗透压是怎样影响细胞生长的？

当细胞内外溶质浓度不同时会产生渗透压差，高渗环境下细胞外溶质浓度升高，水分从细胞内向外扩散导致细胞收缩，可能引起DNA和蛋白质结构损伤、细胞周期停滞并最终导致细胞死亡；低渗环境下细胞外溶质浓度降低，大量水分进入细胞使其肿胀，严重时细胞膜破裂而死亡，因此维持培养液在适宜且稳定的渗透压范围（如260–320 mOsm/kg）对于保障细胞形态、增殖能力以及实验重现性极为关键。

10.为什么有要求培养基中不含酚红？

酚红在一定条件下可模拟部分类固醇激素（尤其是雌激素）的生物学效应，对激素敏感的细胞系（如部分乳腺癌细胞）可能带来干扰，同时酚红也会对某些光学检测或流式细胞术的荧光通道造成背景影响，因此在研究激素反应、内分泌相关信号通路或者对光学信号背景要求非常严格的实验中，通常会选用不含酚红的培养基，以减少对实验结果的干扰。

11.酚红的作用是什么？

酚红在细胞培养基中主要作为pH指示剂使用，在酸性条件下呈黄色，在接近中性时呈橙红至红色，在pH偏碱时则呈暗红或偏紫色，实验者可以通过肉眼观察培养液颜色的大致变化来判断pH变化趋势，但这种判断仅为粗略估计，如需精确控制pH仍应使用pH计或其他定量检测方法。

12.干粉培养基里一定不含NaHCO₃吗？

并非所有干粉培养基都不含NaHCO₃，不同品牌和配方设计可能有所差异，有些干粉培养基配方中不含NaHCO₃，需要使用者在完全溶解后按说明书加入适量NaHCO₃，而也有部分配方已经预先加入合适量的NaHCO₃，因此在使用时应仔细阅读产品说明书或包装标签，确认是否需要额外补加NaHCO₃，并严格按照配方要求进行操作。

13.NaHCO₃的作用是什么？

NaHCO₃与培养箱中的CO₂一起构成碳酸氢盐缓冲体系，用于在37℃、一定CO₂浓度下维持培养基pH的稳定，当细胞代谢产生酸性代谢物时，NaHCO₃/CO₂系统可以对酸度进行缓冲和中和，从而保持细胞外环境的相对恒定，而NaHCO₃的添加量需要与培养箱设定的CO₂浓度相匹配，才能将pH稳定在适宜范围。

14.我们实验室培养箱CO₂浓度一直都是5%，这样可以吗？

CO₂浓度是否合适取决于所用培养基的NaHCO₃含量和配方设计，一般如常规DMEM（NaHCO₃约3.7 g/L）在37℃、5%CO₂条件下即可维持pH 7.2–7.4，有些配方或文献会在5–10%CO₂范围内微调，但“必须≥8%”并不准确；而RPMI 1640或部分1640等（NaHCO₃约2.0–2.2 g/L）通常设计在5%CO₂条件下使用，因此不能简单地用同一个CO₂浓度适配所有培养基，正确做法是查阅具体培养基的说明书或权威资料，按照推荐的NaHCO₃含量与CO₂浓度配套使用，并结合37℃条件下的pH实测结果进行验证。

15.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠是细胞培养中的一种备用碳源和能量底物，在葡萄糖充足时细胞主要利用葡萄糖供能，而在葡萄糖浓度较低或某些特定代谢研究中，细胞也可以代谢丙酮酸钠，部分实验还利用丙酮酸的氧化还原性质来减轻氧化应激，常规使用时丙酮酸钠通常配制为50 mM贮存液，分装于-20℃保存，使用时加到培养基中的终浓度约1 mM，可根据实验需要进行适当调整。

16.谷氨酰胺的作用是什么？

L-谷氨酰胺是绝大多数哺乳动物细胞高度依赖的营养成分之一，它既可通过去氨基反应提供进入三羧酸循环的碳源，为细胞提供能量，又是蛋白质和多种生物大分子合成的重要前体，也是核苷酸等合成所需的关键氮源，但L-谷氨酰胺在水溶液中不稳定，会缓慢降解并产生具有毒性的氨，因此一般以高浓度母液形式在-20℃冻存，使用前现加到培养基中，而已经加入L-谷氨酰胺的液体培养基若在4℃储存超过两周，建议重新补加至原始浓度，以保证细胞获得足够且相对稳定的谷氨酰胺供给。

17.在培养基中加入HEPES有何好处？

传统的NaHCO₃/CO₂缓冲系统在离开CO₂培养箱或在空气中暴露时缓冲能力会下降，而HEPES是一种在生理pH范围内缓冲能力很强的Good’s buffer，加入适量HEPES可以显著增强培养基在pH7.2–7.6范围内的缓冲能力，尤其适用于需要在显微镜下长时间观察、在培养箱外操作时间较长或CO₂条件不稳定的实验场景，通常将HEPES配成1 M母液，室温避光保存，使用时加入培养基使终浓度约为10–25 mM，浓度不宜过高，并注意避光以减少潜在光毒性。

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/