我们的研究结果强有力地支持微小端粒重排在自发性智力障碍中发挥着非常重要作用的观点（我们实验中约有 12%)，并证明荧光基因分型是检测微小端粒重排非常灵敏的方法。此外，相对于需要较多技术经验、结果变动性大的细胞遗传学分析而言，多方面自动化的基因分型在定量和结果客观方面具有优势；基因分型的优点还包括可以直接识别重排染色体的双亲来源。最后，微卫星 DNA 技术在发现与若干人类疾病机制相关的单亲二倍体方面有独特的优势。来源：《分子细胞遗传学技术与应用》

操作方法

荧光基因分型筛查微小亚端粒重排实验

材料与仪器

样品 DNA
PCR 引物 氯化镁溶液 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 混合液 Taq 聚合酶 96孔板 PCR热循环仪 琼脂糖 EB 溶液 上样缓冲液 电泳缓冲液 Long Ranger™ 凝胶溶液 尿素
水平凝胶电泳装置 紫外透射反射仪 滤膜 GS-400 HD ROX ABI 377 自动测序仪

步骤

一、端粒卫星的 PCR 扩增

1.将引物置于冰上融化后轻轻混匀，稍离心。

2.对于每个标记物，准备 12 个反应的混合液包括：196μL 高压蒸馏水、32.5 μL 10XPCR 缓冲液、9.75μL 氯化酶、32.5μLdNTP 混合物、正反向引物各 2uL 和 1U Taq 酶，在冰上操作和保存。

3.将上述 15uL PCR 反应混合液加到 10uL DNA 中，用铝箔胶盖密封 96 孔板。

4.扩增前将 96 孔板放到热循环仪上，94°C 变性 5 min。

5.循环条件为 94°C、30s，55°C、30s 和 72°C、45s，共进行 35 个循环，最后的延伸时间为 72°C、7 min。样品可在- 20°C 保存备用。

1.凝胶电泳：取 3uL 上样缓冲液与 5uL PCR产物混合，上样到含有 5mg/ml EB 用 1XTBE 配制的 1.5% 琼脂糖凝胶上。

2.使用合适的分子质量标准，在 100V 电压下电泳 30min。

3.将电泳后凝胶移到紫外透射反射仪上观察 DNA，确保微卫星的正确扩增。

1.按照 ABI 自动测序仪手册所列方法，把玻璃板和隔板放到指定的盒子里。

2.将 3 mL LongRanger 凝胶溶液和 3 mL10X TBE 混勻，加10.8 g 尿素，溶解后加去离子水至 30 mL，用 0.45um 滤膜过滤。

3.加入 150μL ,10% 的 APS 和 21μLTEMED 后倒胶，使凝胶聚合 lh。

4.按说明书将凝胶盒装进测序仪。

5.按表 2 所示在 PCR 扩增后将等量的每种扩增产物混合在一起（见注释 3)。

6.新鲜配制上样混合液：0.5μLGS-400 HDROX、1xL 上样缓冲液和 5 ml 去离子甲酰胺。

7.将 2μLPCR 产物混合溶液与 3pL 上样混合液混匀。

8.90°C 变性 3 min 后，快速放到冰上。

9.将样点人胶孔中。

10.应用运行 GS36D2400 模块搜集数据。

11.按产品手册说明用 GeneScan 软件进行数据分析。

12.用 GenoTyper 软件确定等位基因的大小。

1.研究表明：细胞遗传学难以辨认的非平衡易位是导致 CT 地中海贫血智力障碍综合征（ATR-16[16])、Wolf-Hirchhorn 综合征 [17]、Miller-Diecker 综合征 [18] 和猫叫综合征（cri-du-chatsyndrome)[19] 智力障碍的原因。

2.用此方法可能会出现的问题是如何确定端粒重排导致的表型。当有一个以上的受累子代、端粒重排与智力障碍共分离时这种关系是明确的。在缺乏智力障碍家族史的条件下，当重排涉及以前智力障碍病例缺失的区域，或者当缺失片段非常大时，就可获得端粒重排的生物学效应证据。在其他病例中，确定小端粒重排的致病性可能更加艰难。

3.为了使获得的所有位点峰高一致，可能需要调整每次混合的比率。

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