关于细胞培养的常见问答
关于细胞培养的常见问答
Q1:贴壁细胞如何进行传代？
去除T25瓶中的旧培养基，加入3–4 ml PBS轻轻吹打清洗1–2次，弃去PBS。再加入约1.5 ml Trypsin-EDTA（1X）消化液，放回培养箱或室温下消化，期间在显微镜下观察：当细胞变圆、细胞间隙增大、部分细胞开始脱落时，立即加入约4 ml完全培养基混匀，以终止消化。轻柔吹打使细胞充分脱离瓶壁后，收集细胞悬液，1000 rpm、室温离心5 min。弃上清，用适量完全培养基重悬细胞沉淀，根据细胞密度按1:2–1:3、1:3–1:6或1:6–1:8的比例分装到新的T25瓶中，并补足每瓶培养基至5–6 ml。最后，将培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养。
Q2:悬浮性细胞应如何传代处理？
一般情况下，仅需在原培养角瓶中持续补加新鲜培养基，稀释细胞浓度即可。当培养液体积过多时，可将细胞悬液转入离心管，1000 rpm、室温离心5 min，弃上清后用完全培养基重悬细胞沉淀。根据细胞密度按约1:4–1:8的比例分装至新的培养瓶中，并补加完全培养基至每瓶4–5 ml，置于37℃、5%CO₂培养箱继续培养。部分悬浮细胞有成团生长的趋势，此时多为生长状态良好，补液时应避免过度和反复吹打，以免破坏细胞团块。
Q3:贴壁细胞传代如何使用胰酶？
贴壁细胞传代时常用的胰酶-EDTA配方包括：0.25% trypsin–0.53 mM EDTA·2Na或0.05% trypsin–0.02 mM EDTA·2Na。消化液浓度过高容易导致细胞碎片、培养液中黑色杂质增多，因此常规细胞传代建议优先使用0.05%胰酶进行消化；对于不易消化的细胞，可使用0.25%胰酶。若细胞密度超过80%，可采用分步消化法，以免过度消化。胰酶一般储存于–20°C，解冻过程在4°C条件下进行。首次开瓶后应立即少量分装于无菌离心管或冻存管中，继续置于–20°C保存，避免反复冻融降低胰酶活性，同时也可减少污染风险。
Q4:如何控制胰酶消化时间？
胰酶消化程度是细胞传代中的关键环节。消化过度会导致细胞碎片和黑色杂质增多，细胞大片脱落，活性下降，且部分细胞会随弃去的胰酶一起流失；消化不足则细胞不易从瓶壁吹下，需要反复吹打，同样会损伤细胞活性。不同细胞对胰酶的敏感性不同，因此消化时间并无固定值，而是受多种因素影响，包括：胰酶的浓度、是否含EDTA、胰酶的保存时间和保存温度、是否反复冻融、加入胰酶的体积、消化温度以及细胞的密度等。实际操作中应在显微镜下动态观察，根据细胞形态变化灵活掌握消化时间。
Q5:细胞离心下来的离心速率应为多少？
细胞在传代或冻存过程中如需回收细胞，一般可采用800–1000 rpm、室温离心5–8 min即可。若转速过高或时间过长，容易造成细胞膜受损、细胞破裂，从而降低细胞存活率，因此不建议使用过高离心力。
Q6:如何区分活细胞和死细胞？
在显微镜下，活细胞通常形态饱满、轮廓清晰，中间略显透亮，具有光泽；而死细胞多较暗淡、皱缩，折光性差。也可采用台盼蓝（Trypan Blue）染色进行细胞计数：活细胞不被染色，死细胞则被台盼蓝染成蓝色，据此计算细胞活率。
在胰蛋白酶中加入EDTA的主要作用是螯合游离的Ca2+和Mg2+，去除这些维持细胞黏附和对胰蛋白酶具有抑制作用的二价离子，从而增强胰蛋白酶的消化效果。通常建议在胰酶消化前，先用不含Ca2+/Mg2+、含EDTA的缓冲液轻轻清洗细胞，以尽量去除培养基中的二价离子，帮助细胞更顺利从瓶壁脱离。
Q8:细胞为何生长不均匀？
细胞传代后若放入培养箱时未充分摇匀，或虽已摇匀但在细胞尚未完全贴壁前又频繁移动培养瓶，容易导致细胞在瓶底分布不均，从而出现生长不均匀的现象。除此之外，频繁开关培养箱造成的振动、培养液体积过少、培养箱搁板不水平等，也都会影响细胞在瓶底的均匀铺展，最终导致生长不均匀。
Q9:培养细胞时应使用5%或10%CO2？
细胞培养基多采用HCO₃-/CO₃2-/H+作为pH缓冲体系，其中NaHCO₃的含量决定了所需的CO₂浓度。一般来说：若培养基中NaHCO₃含量约为3.7 g/L，培养时宜使用10% CO₂；若NaHCO₃含量约为1.5 g/L，则使用5%CO₂即可。因此，应根据所用培养基中NaHCO₃的配方含量来选择5%或10%CO₂。
Q10:培养中常出现一些黑点，是污染吗？
首先肉眼观察培养液是否变浑浊，如果变浑浊，基本可以确定是污染；如果肉眼观察培养液没有变浑浊：在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则，是否运动，是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则，做布朗运动，黑点可能是细胞碎片（可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的），也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的，也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致，快速移动，很可能是细菌污染。
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