人工合成核酸现已成为生物化学的一项重要技术，如今也已经积累了大量的技术经验[1]。核酸能否高效合成，关键在于核酸合成过程中是否对官能团进行适当的保护和脱保护。因此把核酸合成研究的历史说成是保护基团的研究和发展史也不为过。即便是技术突飞猛进的现在,也不能否认保护基的选择依然会在极大程度上左右着核酸合成这一事实。

核酸合成策略

虽然肽、糖链和核酸这三种活性高分子的结构是完全不相同的,但是它们之间的人工合成的基本策略都具有以下几点共通之处:

（1）准备好适当保护的单体

（2）对反应点进行脱保护

（3）接下来让单体进行结合

（4）根据需要多次重复（2）和（3）的步骤

（5）全部进行脱保护

多数肽的侧链具有多种官能团，而糖链具有复杂的立体结构，为此大多数羟基必须被单独保护。虽然与肽和糖链相比，核酸的保护要简单得多，但是若要归纳成为通用的方法依然存在一定困难。

在核酸合成中，需要被保护的官能团是核酸碱基的氨基和糖基的羟基。这两者的脱离条件是正交试验，即一个在脱离条件下时，另一个也需要是稳定状态的，反之亦然。 下面将介绍保护基合成的常用方法。

核酸碱基的保护基

为了避免腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的氨基在核酸链延长反应时发生不必要的副反应，所以需要对其进行保护。胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）由于不含有可反应的官能团，所以无需对其进行保护。

图1. 5种核酸碱基，其中标记出了需要被保护的氨基

苯甲酰基（Bz），乙酰基（Ac），异丁酰基等酰基通常用作这些氨基的保护基。其中，苯甲酰基最经常被使用，因为它不论在酸处理还是碱性水解的条件下都相当稳定，即使在核苷酸（或脱氧核苷酸）的链延长反应中也不会发生裂解或副反应。

近年来，各种带有保护基的核苷在市面上进行贩售, 因此使其被普遍使用。如果想合成市场上没有的特殊结构的核酸，那么自制保护核苷是必经之路。

为了引入保护基团，经常使用两步反应。 简单来说就是在碱基存在的前提下，先在待保护的核苷中加入过量的酰氯，将核酸碱基的氨基和糖基的羟基一起进行酰化反应。然后，再用碱性溶液脱掉酯基，从而得到氨基酰化的衍生物。

图2. 氨基保护示例

此外，还可以通过五氟苯基苯甲酸酯与胞苷的一步反应，得到碱基苯甲酸酯化的核酸[2]。

图3. 用活化酯进行苯甲酰化

在合成的最后一个阶段，这些酰基都需要进行脱保护这一步反应。大多数的情况下，可以用浓氨水在50℃下反应5小时这一条件来脱掉酰基的保护。但在鸟嘌呤的氨基被异丁烯基保护的情况下，会出现例外的抵抗情况。所以此时使用更易被浓氨水脱掉的二甲基甲酰胺基（DMF）作为保护基才是最佳选择[3]。在室温条件下，通过搅拌加入过量的二甲基甲酰胺二乙基缩醛到二甲基甲酰胺（DMF）中，即可引入该保护基对此氨基进行保护。

图4. 鸟嘌呤的DMF保护基

若脱保护难以进行，那么应该选择有“超温和保护基”之称的乙酰基（Ac），苯氧乙酰基（Pac），4-异丙基苯氧乙酰基（iPrPac）等。上保护方法与上述酰化反应机理相同。这些保护基均可以在室温下，用33％氨水和40％甲胺的混合溶液这种温和反应条件下完成脱保护[4]。但使用超温和保护基保护的化合物时，需要注意避免在溶液状态下长期储存时出现缓慢分解的状况。

图5.超温和保护基（从左至右: 乙酰基，苯氧乙酰基，4-异丙基苯氧乙酰基）

糖基的保护基

DNA的羟基位于脱氧核糖3'和5'这两个位点，而RNA的羟基位于核糖2'，3'和5'这三个位点。 但在一般的合成方法中，因为3'位点是反应位点，所以不对此进行保护。

在大多数情况下，5'位的羟基用4,4'-二甲氧基三苯基甲基（DMTr）进行保护。 原因是三苯甲基阳离子被两个甲氧基团所稳定，它们很容易通过弱酸的作用被切断。此外，由于该基团非常庞大，所以它可以选择性地保护5'位的一级羟基。

图6. 4,4'-二甲氧基三苯甲基（DMTr）

核酸合成通常通过氨基保护的核苷与4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯化物（DMTr-Cl）在碱性条件下进行反应引入DMTr基团。而二级的2'位和3'位的羟基有所不同，因此只能保护5'位的羟基。

DMTr基团的脱保护仅需用2～3％二氯乙酸或三氯乙酸的二氯甲烷溶液，反应几分钟即可完成。由于脱掉的二甲氧基三苯甲基基团的阳离子显示为橙色，所以可以用肉眼进行监测反应进程。人工合成RNA的首要前提就是保护2'位的羟基。叔丁基二甲基甲硅烷基（TBDMS）是最常用2'位的羟基的保护基[5]。通常加入1个当量的TBDMS-Cl对于核酸碱基的氨基以及在核糖5'位具有保护基的核苷来进行反应合成。然而，在这种情况下，还会产生3'位甲硅烷基化的副产物，所以该反应后续需要通过硅胶柱色谱法对两者进行分离纯化。

图8.TBDMS基的保护

三异丙基甲硅烷氧基甲基（TOM）也被用于2'位羟基的保护。 TBDMS和TOM基均可通过用氟化物离子如四丁基氟化铵（TBAF）等进行脱保护处理。

参考文献：

1. Colin B. Reese. Oligo- and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis[J].Org. Biomol. Chem., 2005,3, 3851-3868https://doi.org/10.1039/B510458K

2. Jean Igolen,Christophe Morin. Rapid syntheses of protected 2'-deoxycytidine derivatives[J]. J. Org. Chem.,2002,45(23). https://doi.org/10.1021/jo01311a061

3. L. J. MCBRIDE,R. KIERZEK,S. L. BEAUCAGE,M. H. CARUTHERS. ChemInform Abstract: Nucleotide Chemistry. Part 16. Amidine Protecting Groups for Oligonucleotide Synthesis.[J]. Chemischer Informationsdienst,1986,17(32).https://doi.org/10.1021/ja00268a052

4. Reddy M.P.,Hanna N.B.,Farooqui Firdous. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides[J]. Tetrahedron Letters,1994,35(25).https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)73341-7

5. Usman N.,Ogilvie K. K.,Jiang M. Y.,Cedergren R. J.. The automated chemical synthesis of long oligoribuncleotides using 2'-O-silylated ribonucleoside 3'-O-phosphoramidites on a controlled-pore glass support: synthesis of a 43-nucleotide sequence similar to the 3'-half molecule of an Escherichia coli formylmethionine tRNA[J]. Journal of the American Chemical Society,1987,109(25).  https://doi.org/10.1021/ja00259a037

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