基因是生物遗传物质的最小功能单位,基因是可分的。要确定一个基因的界限,不能依赖不同突变型之间的重组频率,而必须进行功能分析。通过突变体的互补作用进行互补测验来确定基因的界限。所谓互补作用是指两个突变型染色体同处于一个细胞,由于相对应野生型基因的互相补偿而使其表型正常化的作用。如果说重组是DNA分子之间直接相互作用的话,那么互补则是在基因表达水平上的作用。互补测验有两个基本条件:①两个突变型染色体同处在一个细胞形成二倍体或部分二倍体;②这两个突变型染色体之间不发生重组或者只发生可忽略不计的极少重组。来源：《遗传学实验教程》

操作方法

基本方案

原理

互补作用可以用来确定两个突变是属于同一基因还是属于不同的基因。如果是同一基因内两个不同位点的突变,它们就不能互补;如果是不同基因的突变则是互补的,此为基因间互补。有时同一基因内的两个突变位点也能发生基因内互补,但基因内互补所恢复的酶活性一般最多只有野生型酶活性的25%,而基因间互补则为100%,因此基因间互补与基因内互补是可以区别的。具有基因内互补作用的基因产物是由几个亚基(多肽链)组成的,这种互补作用是两个不同结构变化的亚基互补而出现具有活性的蛋白质。尽管基因内互补是可以区别于基因间互补的,但互补测验比较复杂。这种测验复杂化的原因包括:①某些结构基因突变(包括转座子插入突变)为极性突变。极性效应影响到突变基因随后结构基因的产物量,这两个基因的突变表型不能互相补偿;②某些调节基因的超阻遏突变,如乳糖操纵子的调节基因is突变,它的突变和Z-Y-双重突变的表型相同,is和z-、is和y-都不能互补,这些对互补结果的分析带来一定的难度。

材料与仪器

大肠杆菌
LB培养液 无菌生理盐水 含链霉素、乳糖和色氨酸的基本培养基平板12皿 乳糖EMB链霉素培养基平板16皿 基本缓冲液250ml β-ONPG溶液 无菌小试管12支
恒温水浴锅 振荡混合器 高压灭菌锅 分光光度计 三角瓶 移液管 培养皿

步骤

1.将供体菌和受体菌分别接入5ml LB培养液中,37℃振荡培养过夜。

2.按表36-1的组合将供体菌与受体菌按1∶1进行混合于无菌试管中,置37℃轻摇30min。

3.将4组混合物分别稀释至10^-5;各取10^-4、10^-5稀释液0.1ml分别涂布在含链霉素和色氨酸平板上,同时取供体菌和受体菌液0.1ml分别涂在以乳糖作为惟一碳源的基本培养基(含VB1)平板上作为对照,置37℃培养2d。

4.观察平板上长出的菌落并计数。从4种互补实验平板上各随机挑选几个菌落分别在EMB乳糖平板上画线分离,将平板置于37℃培养2d。

5.观察EMB乳糖平板上长出的菌落是否有分离现象。

6.将4种实验菌株及EMB乳糖培养基上长出的互补菌落(共12株)分别接种在含乳糖的5mlLB液体中,置37℃振荡培养过夜

7.过夜培养物经4000×g室温离心10min,去上清液;用基本缓冲液洗涤菌体后制成悬浮菌液,调节细胞密度至OD600≈0.3。取1ml菌液,加1滴甲苯,立即振荡10s,打开试管置37℃摇动40min以除去甲苯,然后在37℃水浴中按以下程序进行β-半乳糖苷酶的定量测定。

取1ml经上述处理的菌悬液,加入0.2ml β-ONPG(O-nitrophenylβ Dgalactoside邻硝基苯,β D-半乳糖苷贮藏浓度为4mg/ml,溶液应为无色)轻轻摇动5min后再加入0.5mlNa₂CO₃(1mol/L)中止反应。取出反应混合物用分光光度计测定OD₄₂₀值,比较各菌株的测定值。

注意事项

进行互补测验的菌悬液中细胞密度应保持低浓度,因为高浓度会导致重组发生。

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