在细胞中，蛋白质参与广泛的蛋白质-蛋白质相互作用网络，这些网络以动态“蛋白质机器”的形式出现，它们随着不断变化的细胞内、细胞间和细胞外线索的流入而组装和拆卸。了解蛋白质结构和功能的初步步骤是确定哪些蛋白质相互作用，从而确定相关的生物途径。对于有兴趣通过蛋白质-蛋白质相互作用研究细胞途径的生命科学家来说，Pull-Down技术已成为一种宝贵的工具。

        Pull-Down技术是一种体外用于确定两种或多种蛋白质之间的物理相互作用的方法。Pull-Down试验既可用于确认其他研究技术（例如免疫共沉淀）预测的蛋白质-蛋白质相互作用的存在，也可作为初步筛选试验，用于识别之前未知的蛋白质-蛋白质相互作用。

        Pull-Down技术是一种亲和纯化形式，与免疫沉淀类似，不同之处在于使用“诱饵”蛋白代替抗体。亲和色谱法（即亲和纯化）大大提高了蛋白质纯化的速度和效率，同时提供了对潜在结合伙伴进行Pull-Down或共纯化的技术平台。

        在Pull-Down技术中，诱饵蛋白被标记并捕获在固定的亲和配体上，从而产生“二次亲和支持”以纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白质。然后将固定诱饵的二次亲和支持与含有假定“猎物”蛋白的蛋白质源（如细胞裂解物）一起孵育。此步骤中的猎物蛋白来源取决于研究人员本次实验的目的，是确认先前怀疑的蛋白质-蛋白质相互作用，还是识别未知相互作用。紧接着洗脱蛋白质-蛋白质相互作用复合物后，再通过SDS-PAGE等技术对复合物进行分析。蛋白质洗脱的方法取决于亲和配体，范围从使用竞争性分析物到低pH或还原缓冲液。

        其中，GST Pull-Down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，为排除假阳性所设的一组对照实验是在没有诱饵蛋白存在的条件下，将样品结合到GST上。该对照可以是表达有GST（非诱饵融合蛋白）的分别转化细胞裂解物，也可以是将GST加到非转化细胞的裂解物中。

        除了GST以外，类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+ 的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲蝶呤的色谱柱进行纯化等等。

        以下为GST Pull-Down实验的参考实验流程，不同实验室会有细微差异：

实验步骤

1．构建含GST标签的诱饵蛋白原核表达载体，表达融合蛋白。

（1）将成功构建好表达载体的培养菌液转移到含有500 ml LB（含500 ul氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200 rpm培养数小时。

（2）测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃、200 rpm条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）。

（3）诱导适当时间后，将菌液分次倒入50 ml离心管中，4℃ 4000 rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体（如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中）。

（4）先加入少量PBS于离心管中，离心5-10 min后弃去上清，再按每10 ml菌液沉淀1 ml PBS的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中。

（5）把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20 s，间隔30 s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清。

（6）将超声后的溶液置于4℃、4000 rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。

2．GST-“诱饵”融合蛋白的纯化。

（1）在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B，4℃摇床上缓慢摇动30~60 min;

（2）4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，此时，谷胱甘肽琼脂糖凝胶上结合了GST-“诱饵”融合蛋白；

（3）加入200 ul预冷的PBS溶液，轻晃悬浮微球，将谷胱甘肽琼脂糖凝胶洗涤一次，4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，重复此步骤3次；

（4）最后一次用移液枪吸走微球表面的液体，但注意不要吸走微球，即可获得结合GST-“诱饵”融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶。

3．“猎物”蛋白的制备

        “猎物”蛋白可融合His标签进行原核表达，也可融合Flag/HA/Myc等标签进行真核表达。

4．体外蛋白的结合

（1）将结合有GST-“诱饵”融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B悬浮在适量体积的缓冲液中，加入20 ul含有“猎物”蛋白的溶液，同时采用结合有GST蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶作为阴性对照，在摇床上晃动4-8 h（4℃）；

（2）4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清液；

（3）沿壁加入200 ul预冷的缓冲液对谷胱甘肽琼脂糖凝胶进行洗涤，

（4）4℃，4000 rpm离心5 min，弃上清，该步骤重复3次；

（5）吸干谷胱甘肽琼脂糖凝胶上面的液体后，加入20 ul 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5 min，放入-20℃冰箱备用；

（6）通过SDS-PAGE和Western blot进行检测。

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