可能原因

建议

凝胶准备

 样品数量少

• 确保足够数量的样品加载到凝胶上。凝胶电泳通常需要每个波段的纳米克样品来可视化;因此，一般建议每毫米凝胶孔宽度的0.1-0.2 μg样品。

•        使用具有深孔的凝胶梳，以改善低数量样品的可视化
  

样品降解

• 确保所选试剂是分子生物学级的，实验室器皿中不含核酸酶。在处理核酸时，要遵循良好的实验室实践(例如，戴手套、防止核酸酶污染、在指定区域工作等)，特别是在处理RNA时。

上样染料掩盖目标条带

• 检查电泳中负载染料的表观迁移大小。染料可能会掩盖和隐藏感兴趣的波段，特别是当它们的数量很少的时候。

凝胶运行

凝胶超限运行

• 监视加载染料的运行时间和迁移，以避免较小的样品分子从凝胶上溜走。

电极反接

• 确保电极与电源正确连接。设置水平凝胶时，凝胶孔应与负极在同一侧。

样品可视化

染色敏感度低

• 检查制造商提供的用于检测核酸的荧光染色剂的灵敏度。

• 使用更多的染色和/或更长的染色时间来使单链核酸显色。或者，考虑对单链分子具有较高亲和力的独特染色剂，以增加检测的特异性和敏感性。

• 对于较厚或高百分比的凝胶，允许较长的染色时间，以保证荧光染色剂的充分渗透。或者，考虑具有快速渗透特性的染色剂。

染色剂背景高

• 对凝胶进行脱色，或选择具有低本征荧光的染色剂来避免脱色。

染色不均匀

• 如果样品仅部分可见或仅在凝胶的某些通道可见:

• 对于凝胶内染色，在准备凝胶时，将染色液完全混合琼脂糖溶液(不要产生气泡)。
  

• 电泳后染色时，确保凝胶完全浸泡在染色溶液中，轻轻摇动一定的时间。
  

光源错误

• 如果使用荧光染料进行染色，请检查其激发波长，以确保所使用的光源对激发染料进行可视化是最佳的。

可能原因

建议

凝胶制备

凝胶粘稠

• 浇铸水平琼脂糖凝胶时，确保凝胶厚度在3-4 mm左右。凝胶厚度大于5mm时，电泳过程中可能会出现条带扩散。

上样孔形成不佳

• 在浇铸凝胶之前，请将凝胶梳清洗干净。

• 为了防止样品从凝胶底部漏出，弄脏样品带，不要把梳子一直推到水平凝胶底部。
  

• 避免凝胶槽浇筑过满，因为这会导致上样孔连接。

• 在取下凝胶梳之前，要有足够的时间让上样孔形成。

• 一旦凝胶凝固，小心平稳地取出凝胶梳，以防止损坏上样孔。
  

凝胶类型错误

• 对于单链核酸（如RNA）的电泳，制备一种变性凝胶以进行有效分离。但对于双链DNA样品的电泳，应避免使用变性凝胶。

样品制备

样品超载

• 凝胶电泳中使用的样品不得超过必要数量；一般建议每毫米凝胶孔宽度0.1-0.2 μg样品。而拖尾，弯曲或u形带，以及出现融合的条带是超负荷凝胶的常见特征。

样品降解

• 确保所选的试剂是分子生物学级，并且实验室器皿中不含核酸酶。在处理核酸时，要遵循良好的实验室实践(例如，戴手套、防止核酸酶污染、在指定区域工作等)，特别是在处理RNA时。

样品溶于高盐缓冲液

• 检查加载缓冲液的盐浓度是否与所选凝胶兼容。如有必要，可稀释上样缓冲液。

• 如果核酸样品已经溶于高盐缓冲液中，在加入加载缓冲液之前，将样品在无核酸酶的水中稀释。如果需要，将核酸样品提纯或沉淀，并将其重新悬浮在无核酸酶的水中，以去除多余的盐。
  

样品含有大量蛋白质

• 样品中的蛋白质可能会干扰样品在凝胶中的流动性。通过纯化样品来去除蛋白质，或通过在装有SDS的加载染料中制备样品并在加载之前加热来分离/变性蛋白质。

上样缓冲液不合适

• 对于单链核酸电泳，使用含有变性剂的上样染料，然后加热样品，以防止不必要的双链结构形成。

• 对于双链DNA的电泳，不可使用含有变性剂的上样染料和加热样品，以保护双链结构。
  

加入样品后的凝胶运行

气泡

• 在样品加载过程中，确保没有气泡困在孔中，以避免条带畸形。

上样时损坏上样孔

• 在上样过程中，避免用移液吸头尖刺穿破上样孔。

样品孔含有残留丙烯酰胺和/或尿素

• 当使用聚丙烯酰胺凝胶时，在装载样品之前，将残留的丙烯酰胺（以及变性凝胶中的尿素）从孔中冲洗出来。

电压过低或过高

• 根据核酸的大小范围和使用的运行缓冲液建议施加电压。很低或很高的电压 都会影响核酸分离的最佳效果。

电泳时间过短或过长

• 运行凝胶足够长的时间，以确保条带充分分离。然而，一个非常长的运行可能产生过多的热量，使样品变性，并导致条带扩散。

电泳缓冲液不合适

• 确保凝胶制剂和运行缓冲液兼容并采用正确的方法制备。

• 电泳过程中，推荐使用能够坚持2小时以上的强力缓冲液。
  

样品可视化

条带扩散

• 避免凝胶储存或电泳完成和凝胶显示之间的长时间延迟。否则小分子成分的条带，以及凝胶中包含的核酸染色剂，可能会发生扩散。

共迁移条带

• 使用适当的凝胶百分比、电压和运行时间来分离分子大小相近的条带。共迁移带通常以厚而亮的漫反射带的形式出现。

相机失焦

• 如果凝胶是通过镜头在屏幕上显示，请确保相机是对焦的。

可能的原因

建议

凝胶准备

错误的凝胶比例

• 确保凝胶百分比适合于解析所测含量的样品。较小的分子成分要求较高的凝胶百分比。

• 在制备琼脂糖凝胶时，煮沸后用水调整凝胶体积，以补偿蒸发的水分，防止凝胶的百分比高于预期。
  

未选择最佳的凝胶类型

• 选择一种凝胶类型，以更好地分离样品。建议使用聚丙烯酰胺凝胶来分解核苷酸＜1000 bp。

上样孔形成不佳

• 在浇铸凝胶之前，请将凝胶梳清洗干净。

• 为了防止样品从凝胶底部漏出，不要把凝胶梳一直推到凝胶底部。
  

• 避免凝胶槽填充过满，因为这会导致上样孔连接。

• 在取下凝胶梳之前，要有足够的时间让上样孔形成。

• 一旦凝胶凝固，小心平稳地移除凝胶梳，以防止损坏上样孔。
  

凝胶类型错误

• 对于单链核酸（如RNA）的电泳，制备一种变性凝胶以进行有效分离。

• 双链DNA电泳时，避免使用变性凝胶，以保留双链结构。
  

样品制备

样品超载

• 在凝胶电泳中使用的样品不要超过必要的数量；一般建议每毫米凝胶孔宽度0.1-0.2 μg样品。而拖尾，弯曲或U形带，以及出现融合条带均是超负荷凝胶的常见特征。

样品含有大量蛋白质

• 样品中的蛋白质可能会干扰样品在凝胶中的流动性。通过纯化样品来去除蛋白质，或通过用SDS在负载染料中制备样品并在负载前加热来分离/变性蛋白质。

上样缓冲液不合适

• 对于单链核酸(如RNA)的电泳，使用含有变性剂的负载缓冲液，然后加热样品，以防止不必要的双工链的形成。

• 对于双链DNA电泳，避免负载有变性剂的染料，也不要加热样品，以保存双链结构。
  

样品体积过少

• 确保样品体积填充至少30%体积的孔，以避条带弯曲。

凝胶运行

样品加载期间引入气泡

• 在样品加载过程中，确保没有气泡困在孔中，以避免条带畸变。

上样时损坏上样孔

• 在样品加载过程中，避免用移液吸头刺穿上样孔。

样品孔含有残留丙烯酰胺和/或尿素

• 当使用聚丙烯酰胺凝胶时，在装载样品之前，将残留的丙烯酰胺（以及变性凝胶中的尿素）从孔中冲洗出来。

电压过低或过高

• 根据核酸的大小范围和使用的运行缓冲液建议施加电压。很低或很高的电压会造成核酸分离的效果不理想。

电泳时间过短或过长

• 运行凝胶足够长的时间，以确保条带充分分离。然而，一个非常长的电泳运行时间可能产生过多的热量，使样品变性，并导致条带扩散。

电泳缓冲液不合适

• 确保凝胶制剂和运行缓冲液兼容并采用正确的方法制备。
  

• 确保所用的缓冲液与要分离的样品能很好地工作。例如:
  

1. TAE缓冲液在短时间内分离大片段核酸(1500bp)效果更好。

2. TBE对较短片段核酸(5000 bp)效果更好，但可能会减缓线性dsDNA的迁移。
   

3. 电泳过程建议使用能够支持2小时以上的强力缓冲液
   

可能的原因

建议

凝胶准备

 凝胶不均匀

• 在制备凝胶时，一定要将基质溶液充分混合。琼脂糖溶液煮沸后不应有任何未溶解的粉末或未融化的固体。

凝胶不平整或上样孔倾斜

• 将凝胶槽放在一个平坦的表面上，以便倒入凝胶并插入梳子。凝胶梳应该完全垂直于凝胶表面，平行于凝胶的顶部边缘，并在凝胶凝固期间保持稳定。

凝胶缓冲液不合适

• 确保凝胶在与运行的缓冲液相同的缓冲液中制备。

样品准备

包含不同构象的样品

• 质粒DNA的不同构象（例如超螺旋、线性、松弛/缺口）在电泳中表现出不同的迁移率。

• 在质粒DNA电泳中，除必要外，不要使用过多的嵌入染料，因为它可能会改变质粒的构象。
  

• 当处理单链核酸如RNA时，在样品缓冲液中加入变性剂，并在凝胶加载前加热样品，以保持单链性。
  

样品含有特殊序列

• 在高分辨率电泳中，AT丰富的DNA可能迁移得更慢。

• “弯曲”DNA（大约每10 bp包含4-6个腺苷酸重复序列）在聚丙烯酰胺凝胶中的不规则迁移。
  

• 经过修饰的DNA（例如，甲基化，或生物素或大荧光分子标记）比相同碱基对长度的未修饰的DNA迁移更慢。
  

样品具有粘性末端

• 用SDS加载缓冲液并加热样品，防止具有长互补末端的核苷酸彼此相互作用形成多联体。

蛋白质与核酸结合

• 使用含有SDS的上样缓冲液并加热样品，以破坏蛋白质和核酸之间的相互作用，例如，在限制性消化和连接后破坏蛋白质和核酸之间的相互作用。

凝胶运行

不兼容的运行缓冲区

• 确保凝胶制剂和运行缓冲液兼容并采用正确的方法制备。

• 确保所用的缓冲液与要分离的样品能很好地工作。例如:
  

1. TBE对较短片段核苷酸(5000 bp)效果更好，但可能会减缓线性dsDNA的迁移。

2. 电泳过程中，建议使用能够坚持2小时以上的强力缓冲液。
   

电压过高

• 避免使用超过推荐电压的电压，因为它可能导致产生过多的热量，样品变性以及“微笑”带。

加热过度

• 确保运行中的缓冲液具有较高的缓冲能力，在长时间运行时（2小时）循环/补充缓冲液，并在适当的时候冷却凝胶装置。

• 降低电压，或设置电流或功率恒定。
  

样品可视化

染色与样品结合

• 当使用大荧光染色剂时，考虑电泳后染色，因为染色剂与核酸的结合可能会改变电泳过程中样品的迁移率。

可能的原因

建议

样品准备

不准确的分子量标准品

• 确保使用专门为凝胶定量设计的标准品。这种类型的分子量标准品每个条带都包含已知数量的片段。

样品和分子量标准品使用的上样染料不同

• 用相同的上样染料加载样品和分子量标准品，以获得可靠的定量数据。

样品可视化

所选分子量标准品的波段不正确

• 为了提高精确度，将关注的条带与定量分子量标准品的相似大小的参考条带进行比较来校准。

强度测量不恰当

• 对于更精确的强度测量，从目标条带的测量值中减去凝胶背景。如果可用，使用凝胶成像仪的内置定量软件。

染色不均匀

• 确保荧光染色剂在凝胶或染色溶液中充分混合。

• 确保凝胶完全浸没在染色溶液中。

• 对于较厚或高百分比凝胶，应延长染色时间，以确保荧光染色剂充分渗透。或者，考虑具有快速渗透特性的染色剂。

• 对于变性凝胶，清洗凝胶以去除变性剂，防止对荧光染色剂造成影响。或者，考虑一种抗普通变性剂的染料。
  

可能的原因

建议

样品准备

过载样品

• 凝胶电泳中使用的样品不得超过所需数量；一般来说，每毫米凝胶孔宽度通常0.1-0.2 μg样品就足够了。过载的样品可能残留在凝胶孔中。

样品中的蛋白质和细胞残骸

• 蛋白质和细胞残骸与核酸结合可能阻碍样本迁移。通过纯化样品来去除污染物，或通过用SDS在加载染料中制备样品并在加载前通过加热使其分离/变性。

凝胶运行

没有动力

• 检查电源是否打开/正常工作，并连接到电泳槽。

• 检查当电泳开始时，气泡从电泳室中浸泡的电极中升起（表明随着电流流动，电极上产生气体）。
  

电泳缓冲液不合适

• 确保运行缓冲液和凝胶制备缓冲液兼容，制备方法正确，并且具有良好的导电性。

可能的原因

建议

样品可视化

辐射伤害

• 尽可能减少DNA暴露在紫外光下。

• 使用较长的波长(如360nm)而不是较短的波长(如254-312nm)子紫外光来观察凝胶中的核酸显色处理效果。

• 或者，使用损伤较小、激发波长较长的染色剂来观察DNA。

• 在可视化过程中考虑落射照明代替透射照明。
  

可能的原因

建议

样品准备

加载缓冲区不正确

• 确保加载缓冲液含有密度成分，以便样品沉入孔中。

样品溶液不合适

• 纯化样品，或沉淀后将核酸重悬于无核酸酶的水中。残留的乙醇或提取溶剂会阻碍样品沉入孔底。

可能的原因

建议

样品可视化

荧光污染物

• 凝胶中的灰尘和/或某些微生物可能发出荧光并产生斑点。使用分子生物学级试剂和专用实验室清洁工具来清洁器皿制备凝胶。