一、目的与适用范围

        本规程用于石蜡切片及冰冻切片的苏木精–伊红（HE）常规染色。HE染色通过碱性苏木精选择性显色细胞核等嗜碱性成分、酸性伊红染色胞质及细胞外基质等嗜酸性成分，是组织学、胚胎学及病理学教学与科研中最基础、最常用的染色方法。

二、原理

        在常规染色条件（pH约6）下，细胞内带负电荷的酸性成分（如DNA、RNA、软骨基质等）对碱性染料具有亲和性，表现为嗜碱性；蛋白质等带正电荷部位（如血红蛋白、胶原纤维、肌纤维、嗜酸性颗粒等）对酸性染料具有亲和性，表现为嗜酸性。

          苏木精在与金属盐（如明矾）形成复合并氧化后成为碱性染料，可与DNA磷酸基及核酸结合，使细胞核和某些钙盐、黏液成分染成蓝色或紫蓝色。伊红Y为酸性染料，在水中电离成带负电荷的阴离子，与蛋白质阳离子位点结合，使胞质、红细胞、肌纤维、胶原纤维等染成不同深浅的红色或粉红色。通过先核后质的二步染色及适当分化、返蓝，可清晰显示组织结构与病理改变。

三、试剂与仪器

3.1主要试剂

（1）伊红酒精染色液（0.5%～1%）

称取伊红Y 0.5～1 g，加少量蒸馏水溶解，缓慢滴加冰醋酸直至呈浆糊状，经滤纸过滤后将滤渣在烘箱中烤干，以95%乙醇（或无水乙醇）定容至100 mL，充分溶解备用。

（2）苏木精染液（示例配方，约3000 mL）

苏木精6 g；无水乙醇100 mL；硫酸铝钾150 g；蒸馏水2000 mL；碘酸钠1.2 g；冰醋酸120 mL；甘油900 mL。

配制方法：先将苏木精溶于无水乙醇，将硫酸铝钾溶于蒸馏水后加入甘油混合，再加入苏木精乙醇溶液，最后加入冰醋酸和碘酸钠，充分混匀，静置成熟后过滤备用。

（3）1%盐酸酒精分化液

取70%乙醇99 mL，加入浓盐酸1 mL，混匀备用。

（4）促蓝液/返蓝液

弱碱性溶液，如自来水、氨水–自来水混合液或碱性缓冲液，具体配方按实验室常规设定。

（5）二甲苯（或同类透明剂）、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、蒸馏水。

（6）中性树胶或其他适用封片剂。

3.2主要仪器

常规组织处理及切片设备（石蜡包埋机、轮转式切片机或冰冻切片机）、恒温箱或烘箱、显微镜、通风橱、计时器、耐有机溶剂染色架等。

四、操作步骤

4.1石蜡切片HE染色

4.1.1脱蜡至水

按顺序将切片置于各液体中，轻轻晃动：

（1）二甲苯（Ⅰ）15 min。

（2）二甲苯（Ⅱ）15 min。

（3）二甲苯：无水乙醇=1:1混合液2 min。

（4）100%乙醇（Ⅰ）5 min。

（5）100%乙醇（Ⅱ）5 min。

（6）80%乙醇5 min。

（7）蒸馏水5 min，完全水化。

4.1.2染色与分化

（1）苏木精染色液染色5 min。

（2）自来水或蒸馏水充分冲洗5～10 min（流水条件下至少5 min），去除游离染料并启动部分返蓝。

（3）1%盐酸酒精分化30 s，轻轻摇动，观察核染色由深变浅，避免过分化。

（4）水洗30 s，终止分化。

（5）蒸馏水快速过洗约5 s，去除残余酸性成分。

（6）0.5%伊红酒精染液染色1～3 min，根据所需胞质着色深浅适当调整时间。

（7）蒸馏水稍洗30 s，去除多余伊红，避免背景染色过重。

4.1.3脱水、透明与封片

（1）80%乙醇稍洗30 s。

（2）95%乙醇（Ⅰ）1 min。

（3）95%乙醇（Ⅱ）1 min。

（4）无水乙醇（Ⅰ）3 min。

（5）无水乙醇（Ⅱ）3 min，确保彻底脱水。

（6）二甲苯（Ⅰ）3 min。

（7）二甲苯（Ⅱ）3 min，切片完全透明。

（8）滴加中性树胶封片，轻放盖玻片，避免气泡，常温干燥。

4.2冰冻切片HE染色

4.2.1固定与HE染色

（1）冰冻切片经适宜固定液固定10～30 s（如冷丙酮或酒精类固定液，依实验室常规选择）。

（2）稍用蒸馏水或自来水洗1～2 s，去除多余固定液。

（3）苏木精染色液（60℃预温）染色30～60 s。

（4）流水迅速洗去多余苏木精5～10 s。

（5）1%盐酸乙醇分化1～3 s，视核色深浅快速控制。

（6）稍水洗1～2 s。

（7）促蓝液返蓝5～10 s，至细胞核呈清晰蓝色。

（8）流水冲洗15～30 s。

（9）0.5%曙红或伊红染色液染色30～60 s。

（10）蒸馏水稍洗1～2 s。

4.2.2脱水、透明与封片

（1）80%乙醇1～2 s。

（2）95%乙醇1～2 s。

（3）无水乙醇1～2 s，迅速脱水。

（4）石炭酸二甲苯2～3 s（如不使用，可用无水乙醇代替，但需保证后续二甲苯充分置换）。

（5）二甲苯（Ⅰ）2～3 s。

（6）二甲苯（Ⅱ）2～3 s。

（7）中性树胶封片，常温干燥备用。

五、染色结果与判读

5.1正常着色特征

细胞核：呈鲜明蓝色或深蓝色，核结构清晰；软骨基质、钙盐沉积区及黏液成分多呈深蓝或灰蓝色。胞质：大多数细胞质呈粉红至桃红色，嗜酸性颗粒呈光亮鲜红色。胶原纤维：淡粉红色。弹力纤维：亮粉红色。红细胞：橘红色。蛋白性渗出液：粉红色。不同组织和病变状态下，嗜酸性和嗜碱性程度可有所改变，如幼稚细胞胞质伊红染色较淡或轻度嗜碱，衰老或退行变细胞则常表现为嗜伊红增强。

5.2HE染色评定标准

（1）切片完整，厚度4～6 μm，厚薄均匀，无明显皱褶、刀痕或裂隙。

（2）核浆分明：细胞核清晰锐利、蓝色适中；胞质及基质红蓝对比协调，不偏紫亦不过度红染。

（3）脱水透明充分：封片后背景透明清晰，无白雾状或水浊影，视野内无明显气泡或杂质。

（4）封片牢固，胶液分布均匀，无大范围干裂或边缘脱片。

六、注意事项与常见问题

（1）脱蜡与脱水必须彻底，否则封片易出现白雾状、视野模糊，并影响长期保存。必要时可适当延长无水乙醇及二甲苯时间。

（2）盐酸酒精分化时间要严格控制，核色过深可再短暂分化，过度分化则核淡甚至阴性，只能重染。建议初次使用时多做对照切片摸索最佳时间。

（3）返蓝应在弱碱性环境下完成，自来水水质差异会影响效果，可根据情况使用统一配方返蓝液。

（4）伊红染色时间过长会导致背景过深、组织细节被掩盖；过短则胞质显色过淡。可根据标本类型适当微调。

（5）石炭酸二甲苯虽有较强脱水能力，但停留时间不宜过长，以免导致切片脱色或组织变脆，之后应通过多次二甲苯充分去除其残留。

（6）所有有机溶剂操作建议在通风橱内进行，注意防火与个人防护。

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