一、实验原理

         HepG2属于人肝癌细胞系，具有一定的肝细胞样特性，在游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）过量暴露的条件下，细胞内甘油三酯（TG）会显著积累，形成大量脂滴，从形态和脂质代谢表型上模拟肝细胞脂肪变性状态，因此常用作体外非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等相关研究的细胞模型。

诱导脂肪变性时，多采用油酸（oleic acid，OA）和棕榈酸（palmitic acid，PA）的组合：油酸更易促进甘油三酯合成和脂滴形成，相对毒性较低；棕榈酸的脂毒性更强，可更好地模拟脂质过载时的细胞损伤和炎症反应。二者按一定比例（如0.5 mM OA+0.25 mM PA）联合使用，可在保证脂滴形成明显的同时，兼顾细胞活力和脂毒性效应，更接近体内高脂环境下肝细胞受到的脂质刺激模式。

二、实验材料准备

1.细胞

人肝癌细胞系HepG2。

2.试剂

含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，用于细胞常规培养；

0.25%胰酶–EDTA溶液，用于细胞消化与传代；

游离脂肪酸（FFAs），如棕榈酸钠、油酸钠；

磷酸盐缓冲液（PBS），用于洗涤细胞；

4%多聚甲醛溶液，用于细胞固定；

尼罗红染色溶液、油红O染色液，用于细胞内脂质染色；

DAPI，用于细胞核染色；

谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）测定试剂盒及甘油三酯（TG）测定试剂盒，用于生化指标检测。

3.器材

细胞培养箱（37℃，5%CO₂）；

超净工作台；

离心机；

显微镜；

酶标仪；

细胞培养板及相关一次性培养耗材。

三、操作步骤

1.细胞培养

将HepG2细胞接种于含10%FBS的DMEM培养基中，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱内常规培养。每2–3天传代一次，使用0.25%胰酶–EDTA消化细胞，待细胞生长至对数生长期用于后续实验。

2.配制游离脂肪酸溶液

使用时按照说明书将试剂按一定比例加入到含10%FBS的完全培养基中，即可得到所需浓度的FFAs工作液。常用诱导组合为：0.5 mM油酸钠+0.25 mM棕榈酸钠。

3.诱导细胞脂肪变性

当HepG2细胞生长至约80%–100%汇合度时，弃去原培养基，更换为新鲜的完全培养基（含10%FBS、1%青霉素/链霉素）。随后按上述设定浓度加入高脂细胞添加剂，对照组加入等体积溶剂对照。加药时应缓慢、轻柔地将试剂滴加至培养皿或培养板中，并轻轻晃动混匀，避免局部出现高浓度区域导致细胞损伤。处理后将细胞放回细胞培养箱中继续孵育，一般可先设置24 h作为初始参考条件。

在正式实验前，建议通过浓度梯度和时间梯度预实验，筛选适合所用HepG2细胞的最佳游离脂肪酸作用浓度和处理时间。常见诱导时间可尝试24、48、72 h等条件，从脂滴形成程度、细胞形态和细胞活力等多指标综合评估后确定最佳建模条件。

4.细胞检测

（1）生化指标检测

按ALT/AST测定试剂盒说明书操作，测定培养上清或细胞裂解液中的ALT、AST水平；同时依据TG测定试剂盒操作流程检测甘油三酯含量，用于反映细胞内脂质积累及脂质代谢变化情况。

（2）细胞染色观察

用PBS轻柔洗涤细胞后，加入4%多聚甲醛于室温下固定约10 min，固定结束后再用PBS洗涤并加入尼罗红染色溶液，在避光条件下孵育约10 min，随后用DAPI对细胞核进行染色；也可改用油红O染色液对细胞内脂质进行染色，并按照既定染色方案完成相应的洗涤与核染步骤。染色完成后，在显微镜下观察细胞内脂滴的形成情况及分布特征，比较对照组与高脂处理组之间的差异，以评估HepG2细胞脂肪变性模型是否建立成功及脂肪变性程度。

四、常见问答

Q1：建立HepG2脂肪变性模型时，一定要使用含血清的培养基吗？

文献和实际经验表明，在含10%FBS的完全培养基中加入OA/PA，既能保证细胞活力，又能获得稳定的脂滴积累，因此含血清培养是一种常用且相对稳定的条件。若在无血清条件下诱导，脂质摄取和细胞应激状态可能发生变化，脂毒性也有可能增强，需要重新进行条件摸索和安全性评估。对于多数常规药效筛选和机制研究，使用含血清的完全培养基更易获得可重复结果。

Q2：HepG2细胞在加游离脂肪酸后大量死亡或脱落，可能是什么原因？

常见原因包括FFAs浓度过高、加药方式不当导致局部高浓度刺激、作用时间过长以及细胞本身状态欠佳等。可通过适当降低FFA总浓度或调整OA/PA比例（一般减少PA比例有助于降低脂毒性）、在加药前先将FFA与完全培养基充分混匀后再缓慢加入培养板中以避免局部高浓度、缩短诱导时间（例如先从24 h起步，再视情况逐步延长）、并确保诱导前细胞处于良好状态（避免在严重过汇合或长期未传代的细胞上建模）等方式进行优化和排查。

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