本单元讲述了 5'-核酸酶等位基因特异性分析或 TaqMan 法在单核苷酸多态（SNP) 分型的应用。

操作方法

使用TAQMAN分析法的高通量基因分型实验

材料与仪器

基因组DNA
PCR 混合液
96孔透明板和盖子 水平离心机 ABI PRISM 7700 测序系统 热循环仪 统计软件包

步骤

1.96孔透明板B到H行每孔加2ul (30ng）基因组DNA，保留A行作对照—其中4孔只加2ul缓冲液作为「无 DNA」对照，余下8孔每孔加24基因组DNA作为阳性对照，两种纯合子各加4孔。

2.每孔加23ul PCR混合液，盖上透明盖，在水平离心机上短暂离心，用ABI PRISM 7700测序仪得到一个PCR反应前荧光读数。使用「PlateRead」形式，确保选中Use Spectral Compensation forEndpoint 项（在Advanced Optionsinthe Instrument and Diagnostics菜单下）。

3.用下面的条件在热循环仪上开始PCR。

1个循环：2 min 50°C

1个循环：10min 95°C(变性）

40个循环：15s 94°C(变性)

1 min 62°C(复性/延伸)

最终步骤：无限4°C(维持）

4.再次读取荧光得到一个PCR反应后读数。如果使用ABI PRISM 7700提供的等位基因分析（allele-calling)软件，选用「AUelicDiscrimination」模式读取焚光，通过算法可以自动分出基因型或通过视觉检查进行基因分型。

如果进行大规模基因分型（如样本数>500)，将多个孔板的样本数据集中起来确定基因型显得更为准确。这样，请遵照本方案中的剩余步骤。

5.将原始数据（含 PCR 前和 PCR 后的）从孔板读数形式导入统计软件包。用如下方式计算标准化的荧光值：（报道荧光值一背景）/(参照荧光值一背景）；报道荧光在 FAM 和 VIC 道，参照荧光在 ROX 道。

6.用一种非参数的测试（如 Kruskal-WaUis 测试）比较孔板之间每一种报道染料的平均 PCRhli 标准灭光。如果一块孔板（或一组孔板）的 pcR 前突光显著的不同于其他孔板，则相应的调整 PCR 后荧光值。例如，某一特定孔板的 FAM 报道染料的平均荧光是其他孔板的 1.5 倍，则该板每一孔的 PCR 后 FAM 荧光值除以该因数。

7.使用逐步聚类分析（K-meansclustering) 自动将已校正的 PCR 后数据分成 4 组—3 个基因型和 1个「无DNA」对照。大多数统计软件包提供了可以直接使用的聚类分析算法。

通常，聚类是明显的而无需进一步处理。为确定基因型分配是否有意义，检查数据的散点图很重要。例如，极端值会破坏聚类分析算法而产生明显错误的分类结果。去除这种极端值通常就有正确的分类结果。

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