一、实验目的

利用Hoechst核染色观察细胞核染色质形态，形态学判定并半定量分析细胞凋亡比例，适用于贴壁细胞和悬浮细胞的体外凋亡模型。

二、实验原理

Hoechst染料是一类可以与DNA结合的蓝色荧光染料，常用的有Hoechst33342和Hoechst33258，其中Hoechst33342脂溶性更强，能够较好穿透活细胞膜，因此在活细胞染色中应用更为广泛。该类染料主要插入DNA的小沟（minor groove），偏好与富含A–T碱基区域结合，结合后荧光信号显著增强，并在紫外激发下发出明亮的蓝色荧光。

在细胞凋亡过程中，染色质会发生典型变化：早期凋亡阶段出现染色质边缘化与浓缩，晚期凋亡则可见细胞核断裂成多个核碎片，甚至形成凋亡小体。由于DNA的浓缩和空间重排，Hoechst染料在凋亡细胞中常呈现更强、更致密、更不均匀的荧光信号，而正常细胞核则一般呈圆形或椭圆形、染色均匀、边界清晰。通过荧光显微镜观察并比较不同处理组之间的核形态和染色模式，即可对凋亡程度进行定性或半定量评估。

三、适用范围

各类贴壁细胞（如上皮细胞、肿瘤细胞系等）。

悬浮细胞（如淋巴细胞系等）。

各种药物、辐射、缺氧/营养剥夺等诱导的凋亡模型。

四、试剂与材料

1.细胞与培养

待检测细胞系，处于对数生长期。

完全培养基（按细胞系常规配制）。

凋亡诱导处理：如化疗药物、DNA损伤剂、细胞因子撤除等。

对照组：阴性对照（未处理或溶剂对照）、阳性对照（已知强效凋亡诱导处理）。

2.染色相关试剂

Hoechst染料：制备母液1–10 mg/mL，溶于无水DMSO或去离子水，小分装避光，-20℃保存。

Hoechst工作液：使用PBS、HBSS或无血清培养基稀释，常用终浓度0.5–10 μg/mL（需预先优化）。

PBS（pH 7.2–7.4）。

4%多聚甲醛固定液（如需固定染色）。

封片剂（可选抗荧光淬灭类型，固定染色时使用）。

3.耗材与器材

6孔板、12孔板或玻底皿（贴壁细胞）。

离心管、载玻片和盖玻片（悬浮细胞或玻片培养）。

CO₂细胞培养箱、生物安全柜。

离心机（处理悬浮细胞）。

配有DAPI/Hoechst通道的荧光倒置显微镜或共聚焦显微镜。

五、操作步骤（贴壁细胞）

5.1细胞接种与凋亡诱导

1）按实验设计将贴壁细胞接种于6孔板或玻底皿中，待实验时细胞密度约50–70%融合。

2）给予凋亡诱导处理（药物、辐射、缺氧等），根据模型设定处理时间。

3）设置阴性对照和阳性对照组，用于判读比较。

5.2活细胞Hoechst染色（可实时观察）

1）配液：按预实验确定的终浓度（建议起始1–5 μg/mL）配制Hoechst工作液，使用无血清培养基或PBS。

2）洗涤（可选）：吸去培养基，轻柔加入预温PBS洗涤1次，去除残余血清和药物。

3）染色孵育：向每孔加入足量Hoechst工作液完全覆盖细胞，37℃、5%CO₂、避光孵育10–20 min。

4）洗涤（可选）：孵育结束后，可用PBS轻洗1次减少背景；也可不洗涤直接在工作液中观察，根据预实验确定。

5）显微观察：将培养板置于倒置荧光显微镜；在DAPI/Hoechst通道下观察，调整曝光时间，避免信号饱和和光毒性；采集多个随机视野图像用于后续统计。

5.3固定后Hoechst染色（适合长期保存与多重染色）

1）吸去培养基，用PBS轻洗细胞1–2次。

2）加入4%多聚甲醛，室温固定10–15 min，避免时间过长。

3）倾去固定液，PBS洗涤2–3次，每次约5 min。

4）用PBS或去离子水配制Hoechst工作液，推荐起始终浓度0.5–2 μg/mL。

5）室温避光孵育10–15 min。

6）PBS洗涤2次，去除未结合染料。

7）如在玻片上培养或需封片：滴加适量封片剂，加盖玻片，避免气泡，静置片刻。

8）在荧光显微镜下观察和拍照，记录不同组别图像。

六、操作步骤（悬浮细胞）

6.1细胞收集与凋亡诱导

1）按实验设计将悬浮细胞调整至适宜密度（如1–5×10⁵ cells/mL）。

2）给予药物或其他措施诱导凋亡，设定相应时间。

3）设置阴性和阳性对照。

6.2悬浮细胞Hoechst染色

1）将待染色细胞转入离心管，记录体积。

2）以300–500 g离心5 min，弃上清。

3）使用PBS或无血清培养基重悬细胞，调整体积使细胞浓度适中。

4）加入Hoechst工作液至预定终浓度（如2–10 μg/mL），轻轻混匀。

5）37℃避光孵育10–20 min。

6）如需降低背景，可再次300–500 g离心5 min，弃上清后用PBS重悬细胞。

7）取5–10 μL细胞悬液滴加于载玻片，覆盖盖玻片。