流式细胞术是一项非常实用的技术，其特点是方便快捷，结果准确，且能成功的对目标细胞进行分选，但是提起流式抗体具体要怎么选，估计很多小伙伴都会犯难，确实，想获得一个漂亮的流式结果图没有那么容易，实验前最需要考虑的是抗体的选择和荧光素的搭配。

选流式抗体需注意哪些问题?

抗体的基本要求

        a. 清楚知道待测靶标是胞内还是胞外蛋白；

        b. 严格按照样品来源选择抗体反应性；

        c. 必须选择明确标注可用于流式实验的抗体，不能用普通抗体代替。

流式细胞仪的要求

        a.了解所用的流式细胞仪有几个激光器，常见的激光器有405nm、488nm和633nm等，目前大部分的流式细胞仪都配有488nm和633nm2个激光器；

        b. 知道每个激光器下有几个检测通道，通道数决定一次最多测多少个指标；

荧光标记的选择

       a. 有直标抗体的话，尽量选直标，间接标记二抗增加实验步骤，多次清洗造成会细胞损失，染色准确性也低；

       b. 弱表达靶标，尽量选择强荧光素标记抗体，PE>APC>FITC>PerCP。

多色搭配方案

       a. 每个通道只能用一种标记，如FITC和AF488，两种标记的激发波长和发射波长均相近，所以不能同时用这两种标记；

       b. 尽量减少光谱重叠，如PE-cy5和APC，两者同用时调补偿值过大；

       c. 弱靶标配强荧光素，如Treg细胞中CD4表达量高于FoxP3，所以FoxP3应使用强荧光素标记抗体；

       d. 五色及以上配色建议查阅文献，或者咨询抗体厂商。

如何调补偿?

       多色流式实验，由于各个荧光素存在光谱的重叠，因此需要进行补偿调节，下图为FITC和PE两种荧光素的光谱图，在550nm附近，两种染料存在光谱重叠。

下图为CD3-FITC，CD4-PE的染色补偿调节过程 

同型对照?

        同型对照的目的是为了减少背景干扰，更好展现抗原与抗体的结合强度，尤其对于一些胞内蛋白、低表达或连续表达蛋白，同型对照的设置显得尤为必要。同型对照需要选择与染色的单克隆抗体相同种属来源，相同抗体亚型，相同荧光标记的抗体。

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