血浆游离DNA（cell-free DNA,cfDNA）在肿瘤液体活检、产前检测、移植监测及感染病原监测等领域被广泛应用。由于cfDNA含量低、片段短且易受前分析因素影响，提取环节直接决定下游qPCR/ddPCR/NGS的灵敏度与可重复性。

一、什么是血浆游离DNA？

血浆游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）是指存在于血液中、脱离细胞的DNA。其主要来源包括：①白细胞在凋亡或崩解时释放的DNA；②坏死组织，尤其是肿瘤组织进入血液的DNA；③感染所致的病毒或细菌来源的DNA。如今，cfDNA已被视为一种新型生物标志物，广泛应用于孕妇产前筛查与诊断、肿瘤检测、器官移植后的排斥反应监测以及感染检测等领域。

二、前分析要点

cfDNA是多系统来源的细胞外DNA的混合体，其中肿瘤来源ctDNA常以极低等位基因频率（Variant Allele Frequency,VAF）存在。要获得可重复、可追溯的检测性能，前分析与提取化学需协同优化：

v采血与处理时间：优先使用EDTA或cfDNA稳定管；采后尽快双离心去除细胞与细胞核残余，避免白细胞裂解导致gDNA污染。

v储存与运输：血浆应低温保存，避免反复冻融；必要时分装。

v污染控制：设置空白对照（无模板、阴性血浆）监控环境与塑料耗材背景。

三、影响cfDNA提取效果的核心维度

1.短片段回收能力（~150–200 bp）

v直接决定ctDNA检出灵敏度与甲基化/超深度测序的有效分子数。

v关注对<150 bp极短片段的回收曲线与片段偏倚。

2.起始体积与洗脱体积

v大体积上样（常见2–5 mL血浆）+低洗脱体积（20–100 µL）能显著提高检测下限。

v洗脱缓冲的成分与体积会影响下游酶反应抑制与建库效率。

3.通量与自动化能力

v磁珠法更易上KingFisher、Maxwell等平台；柱法在大体积/低洗脱上有传统优势。

v关注一次性耗材、动手时间与批次内/间变异系数（CV）。

4.下游兼容性

vNGS（含捕获/扩增建库）、ddPCR/qPCR、甲基化/亚硫酸氢盐转化等流程的容忍度。

v选择“抑制物残留低、盐/乙醇去除充分”的工艺。

5.基质适应性

v对溶血、脂血、黄疸样本的容忍度与恢复策略（延长蛋白酶消化、增加洗涤等）。

四、cfDNA提取方法

3.1硅胶膜（离心柱/真空柱）

原理：在高盐/低pH条件下，DNA吸附在硅胶膜上，洗脱时在低盐条件下释放

优势：对短片段回收成熟稳定；适配大体积上样与低体积洗脱；流程直观。

限制：高通量与无人值守自动化能力有限（但可用多联真空歧管部分缓解）。

典型应用：高灵敏度ctDNA、甲基化检测、miRNA/cfRNA（需专用流程）等。

3.2磁珠（溶液相固相吸附）

原理：通过聚乙二醇（PEG）和盐调控DNA在磁珠上的吸附

优势：适合自动化批量；操作时间短、人员差异小。

关键点：磁珠/PEG/盐配方决定片段选择性；需关注对100–200 bp片段的回收曲线。

典型应用：常规液体活检筛查、队列样本高通量提取、端到端自动化流水线。

五、常见问题与排错（FAQ）

Q1：cfDNA总量偏低，TapeStation基本无峰？

检查采后延迟处理与溶血；尝试增加输入体积并降低洗脱体积；延长蛋白酶消化与裂解时间。

Q2：建库失败或产量低？

判断是否有盐/乙醇残留：适当延长柱上干燥或磁珠风干；更换无EDTA洗脱。

Q3：背景gDNA偏高、片段带拖尾？

加强双离心与上清转移时避免扰动；提高去蛋白与洗涤强度；必要时在文库前加一次0.8×磁珠截留大分子。

Q4：极低VAF检出不稳定？

重点优化短片段回收与洗脱体积；提高输入血浆体积；使用UMI建库与ddPCR复核。

六、阿拉丁典型产品

Ø磁珠法游离DNA提取试剂盒（货号M669906）磁珠法大体积游离DNA提取试剂盒（货号M670148）高盐时，游离DNA结合于硅基包被的磁珠表面。漂洗后，游离DNA洗脱于Buffer EB或去离子水中。纯化得到的游离DNA质量稳定、可靠，可用于定量PCR、产前诊断等下游实验。

Ø游离DNA提取磁珠（货号F1456624）专为游离DNA提取而设计的磁性固相载体磁珠，特别的生产工艺使其磁性、捕获短片段能力更强，其表面硅羟基在高盐低pH条件下与核酸发生特异性结合，提高的基因组纯度高，得率高，搭配自动化核酸提取平台，使整个提取流程更高效、更安全，可广泛应用于生命科学领域的研究和应用。

Ø游离核酸提取试剂盒（货号C665709）本试剂盒采用可以特异性结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，样品裂解后，游离DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐、高pH值时游离DNA从硅胶膜上洗脱下来。本品可以处理0.1-1 ml的液体样本，配置的高效微量吸附柱洗脱体积可低至20 μl。

Ø游离核酸DNA中量提取试剂盒（货号C665715）本试剂盒使用负压法，同时配备延伸管，可处理多达5 ml样本，纯化的DNA产量高、质量好，最大限度去除蛋白、色素、脂类及其他抑制性杂质污染。纯化得到的游离DNA质量稳定、可靠，可直接用于PCR、荧光定量PCR和二代测序等分子生物学实验。

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