HPTS作为比率荧光pH探针的原理与机制

8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（HPTS，又称吡喃宁）是一种荧光染料，其羟基可根据局部pH发生可逆的质子化与去质子化反应。在质子化（酸性）状态下，HPTS的最大吸收波长约为405 nm；在去质子化（碱性）状态下，吸收峰红移至约450 nm。两种形式的发射波长均约为510 nm。

这种双激发、单发射特性使比率荧光测定成为可能：在约450 nm与约405 nm激发下所得发射强度之比与pH定量相关，且基本不受染料浓度、光程或仪器波动的影响。HPTS在水溶液中的pKa约为7.3，因此特别适合监测6.0–8.0范围内具有生理意义的pH变化。

由于HPTS携带三个磺酸基团，呈强负电荷，不易透过脂质双分子层。这一膜不通透特性在基于脂质体的离子通道和转运体检测中被充分利用：包封于囊泡内的HPTS可选择性报告囊泡内部pH，不受外部游离染料的干扰。

材料与试剂配制

所需材料

• 8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（HPTS），产品编号H131275
• 适用于目标pH范围的水性缓冲液（如磷酸盐缓冲液PBS、HEPES缓冲液或磷酸钠缓冲液）
• 已校准的pH计及标准pH校准缓冲液
• 具备双激发检测功能的荧光分光光度计或荧光酶标仪（激发波长405 nm和450 nm，发射波长510 nm）
• 容量玻璃器皿、低吸附微离心管
• 脂质体检测还需：脂质薄膜、挤出装置、尺寸排阻色谱柱或透析膜

HPTS储备液配制

1. 称取适量HPTS（三钠盐形式分子量为524.38 g/mol；以质量检验报告COA为准）于洁净容器中。
2. 溶于所需水性缓冲液中，配制1–10 mM储备液。HPTS水溶性良好，室温下通常可迅速溶解。
3. 如需无菌溶液，通过0.2 µm滤膜过滤。
4. 储备液避光保存于2–8 °C，避免反复冻融。

工作液配制

• 溶液相pH检测：将储备液稀释至检测缓冲液中，终浓度1–10 µM，用已校准pH计调节至目标pH值。
• 脂质体包封：用含0.5–1 mM HPTS的目标内部缓冲液水化干燥脂质薄膜制备脂质体，通过聚碳酸酯膜（如100 nm孔径）挤出以获得均一粒径的囊泡。通过尺寸排阻色谱（如Sephadex G-25）或充分透析去除未包封的外部HPTS。

荧光测定步骤与校准

仪器参数设置

• 激发波长：405 nm和450 nm
• 发射波长：510 nm（推荐带通10–20 nm）
• 对每个样品分别在两个激发波长下测定荧光强度，计算比值R = F(450)/F(405)。

校准曲线建立

1. 在覆盖目标pH范围的一系列缓冲液中（如pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）配制等浓度HPTS工作液，各pH点选用具有适当缓冲能力的缓冲体系。
2. 测定每个标准品的荧光比值R = F(450)/F(405)。
3. 以R对pH作图，用S形曲线拟合（如应用Henderson-Hasselbalch方程），拐点应位于pH 7.3附近。
4. 利用校准曲线将未知样品的测定比值换算为pH值。

样品测定

1. 测定前将所有试剂及比色皿/反应板预平衡至目标温度。
2. 将样品加入比色皿或孔板。脂质体检测时，将囊泡悬液加入已知组成的外部缓冲液中。
3. 记录至少1–2分钟的基线荧光比值。
4. 启动检测（如加入离子载体、成孔肽或待测化合物以触发离子/质子转运），持续监测荧光比值随时间的变化。
5. 动力学检测结束后，加入膜通透化试剂（如去垢剂Triton X-100，或质子载体CCCP联合碱脉冲）使囊泡内外pH完全平衡，获取最大值和最小值用于归一化（如有需要）。

数据分析、故障排查与安全注意事项

数据分析

利用校准曲线将原始荧光比值换算为pH值。对于脂质体转运动力学检测，囊泡内部pH随时间的变化（ΔpH vs. 时间）反映质子或离子跨膜通量速率。适当情况下，以完全平衡终点值为参考对ΔpH或ΔF进行归一化处理。对重复实验进行适当的统计分析。

故障排查

安全与操作注意事项

使用前请查阅H131275的安全数据表（SDS）。HPTS急性毒性普遍认为较低，但仍须遵守标准实验室安全规范：佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。操作固体粉末时避免产生粉尘。按照荧光染料废液的当地法规处置废液。