试剂盒概述与原理

Human Th1/Th2/Th17染色试剂盒（室温组分）（货号：H1521256NT）专为人T辅助细胞亚群关键细胞因子的多参数流式细胞术同步检测而设计。Th1细胞以分泌IFN-γ为特征，Th2细胞以分泌IL-4为特征，Th17细胞以分泌IL-17A为特征。由于上述细胞因子主要储留于胞内，可靠的检测需要经过优化的细胞刺激、固定及细胞膜破膜步骤。

室温（RT）组分的标注表明，该试剂盒中的关键试剂——包括固定液和破膜液——均配制为可在室温条件下稳定储存和使用，简化了冷链要求及台面操作流程。本试剂盒适用于人源样本的研究，如从外周血分离的PBMC或经处理的全血样本。

所需材料与样本制备

需自备材料（试剂盒不含）：

• 细胞刺激试剂：佛波酯（PMA）和离子霉素（ionomycin），或抗原特异性刺激物
• 蛋白转运抑制剂（如布雷菲尔德菌素A或莫能菌素），用于刺激过程中阻断细胞因子分泌
• 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2–7.4
• 流式细胞术专用管或板
• 配有适当激光线和滤光片组合的流式细胞仪（与所用荧光素匹配）
• 可达300–500 × g的离心机

样本制备：

通过密度梯度离心（如Ficoll-Paque法）从肝素化人外周血中分离PBMC，以推荐密度（通常1–2 × 10⁶细胞/mL）重悬于完全培养基中。也可按厂商特定稀释说明使用全血。刺激前需确保细胞活力超过85%，以保证实验结果的可靠性。

分步染色操作方案

第一步——细胞刺激：在含PMA（通常50 ng/mL）和离子霉素（通常1 µg/mL）及蛋白转运抑制剂（如布雷菲尔德菌素A，10 µg/mL）的标准培养条件下（37°C，5% CO₂）培养细胞4–6小时。上述浓度仅供参考，请以试剂盒说明书中的特定建议为准。

第二步——表面标志物染色（可选）：刺激结束后，用PBS洗涤细胞，加入表面标志物抗体（如抗CD4）在室温避光条件下染色20–30分钟，再用PBS洗涤两次。

第三步——固定：向各样本中加入试剂盒附带的固定液，按试剂盒说明书规定的时间在室温下孵育，然后用破膜液洗涤细胞。

第四步——破膜：将细胞沉淀重悬于试剂盒提供的破膜液中，按说明书要求在室温下孵育。

第五步——胞内细胞因子染色：无需洗涤，直接向破膜后的细胞中加入荧光素标记的抗IFN-γ、抗IL-4和抗IL-17A抗体（试剂盒附带或指定），在室温避光条件下孵育20–30分钟。

第六步——洗涤与上机检测：用破膜液洗涤细胞两次，再用PBS洗涤一次，重悬于适量PBS或鞘液中上机检测。请设置单色补偿对照管及荧光减一（FMO）对照管，以确保门控准确。

数据分析与结果解读

数据采集完成后，使用流式细胞术分析软件（如FlowJo、FCS Express或同类软件）对文件进行分析，推荐采用以下顺序设门策略：

1. 散射光设门：以FSC vs. SSC圈定淋巴细胞群，排除碎片和死细胞。
2. 单细胞设门：以FSC-H vs. FSC-A排除细胞聚集体（doublets）。
3. 活性染料设门：若加入了活性染料，排除非活细胞。
4. CD4⁺ T细胞门：圈定CD4⁺细胞，将分析聚焦于T辅助细胞群。
5. 细胞因子门：在CD4⁺细胞群内，利用FMO对照管设定门界，分别圈定Th1（IFN-γ⁺）、Th2（IL-4⁺）和Th17（IL-17A⁺）亚群。

以CD4⁺ T细胞门内细胞因子阳性细胞的百分比报告结果；若使用体积计数采集，可同时报告绝对数量。将刺激样本与未刺激（阴性）对照进行比较。还可通过布尔设门定量同时表达多种细胞因子的多功能细胞。

故障排除与储存指南

常见问题及解决方案：

储存：室温组分应在室温（15–25°C）、避光条件下保存，除非试剂盒说明书另有规定。请勿冷冻标注为室温保存的组分。批次特定的有效期信息请参阅质量检验合格证（CoA）。长期保存指导请参考各组分标签说明。